好氧顆粒污泥EPS動態變化解析

　1 引言

　　好氧顆粒污泥相比傳統的絮體污泥，具有規則而緊密的微生物結構、高污泥濃度、杰出的沉降性能和耐沖擊負荷等許多優越的性能，因此，近年來備受關注.影響顆粒污泥形成的因素很多，其中，研究者們較一致地認為顆粒污泥的形成與胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)的產生有關.胞外聚合物是微生物在一定環境條件下分泌于胞外的復雜非均相高分子聚合物，是菌膠團、顆粒污泥和生物膜的重要組分，是維持污泥三維空間的重要骨架.目前，人們對好氧顆粒污泥中EPS的成分、提取方法、性能、影響因素等方面均進行了相關的研究，但好氧顆粒污泥形成過程中EPS的變化和作用機制仍然有待進一步明晰.因此，本研究通過建立一個SBR污水處理系統，分別進行普通活性污泥和好氧顆粒污泥培育，探索污泥顆粒化過程中EPS的動態變化、組分及在污泥中的空間分布.

　　2 試驗方法與材料

　　2.1 原水配制與接種污泥

　　反應器試驗用水采用人工配制污水，主要成分有CH3COONa、NH4Cl、KH2PO4、FeSO4、MgSO4、CaCl2和微量元素.進水COD為600~800 mg · L-1，氨氮為50~60 mg · L-1，總磷為9 mg · L-1左右.試驗接種的污泥來源于浙江省杭州市一座城鎮污水處理廠二沉池.

　　2.2 試驗裝置及運行方式

　　反應器高100 cm，直徑10 cm，有效容積為4 L，由頂部進水，每周期出水2 L，系統采用時間控制器進行控制，周期均為4 h.本試驗根據不同運行工況可分為3個階段：第1階段(0~28 d)，進水10 min，曝氣3 h，沉淀40 min，出水和閑置10 min;第2階段(28~46 d)，沉淀時間由40 min縮短為10 min;第3階段(46~72 d)，沉淀時間由10 min縮短為3 min.培養溫度為室溫.分別在第24、33和72 d對反應器中混合液進行EPS提取和檢測.

　　2.3 EPS的分析方法

　　本研究將總EPS按照組分與細菌分離難易程度及其空間分布分為3類：溶解性EPS、松散結合型EPS和緊密結合型EPS.其中，溶解性EPS是指與細胞薄弱連接或溶解在污泥所處系統中由細胞分泌或自溶產生的高分子聚合物;松散結合型EPS是指位于結合型EPS外沿，沒有明顯邊界、松散分散分布的黏性層;緊密結合型EPS是指位于結合型EPS內部，與細胞表面緊密穩定結合的具有特定形狀的黏性層.同時采用EPS中的兩大組分蛋白質和多糖之和來表征總EPS.

　　污泥預處理和EPS提取采用加熱離心法.取泥，泥量為烘干后120~200 mg(如4000 mg · L-1可取40 mL);將樣品在4000 r · min-1下離心15 min，取上清液檢測溶解性EPS(Soluble EPS，S-EPS);之后再將樣品在4 ℃、10000 r · min-1(Sigma 3218K型高速離心機)下離心15 min，取上清液檢測松散結合型EPS(Loosely-bound EPS，LB-EPS);重新懸浮在去離子水中，重復上述離心操作，然后將其置于玻璃勻漿器內4 ℃下勻漿5 min，使樣品均一化(勻漿的目的是讓聚合物充分暴露，若為顆粒污泥需要搗碎才能盡可能多的提取EPS)，加入蒸餾水稀釋到40 mL，攪勻，放入80 ℃水浴鍋加熱60 min，將樣品在4 ℃、12000 r · min-1下離心30 min，得上清液檢測緊密結合型EPS(Tightly-bound EPS，TB-EPS);過0.22 μm的濾膜，取樣5 mL左右，同時取100 mL混合液測定VSS，最終采用單位質量污泥所產生的EPS來表征反應器系統中的EPS濃度.

　　蛋白質的測定采用改良型BCA蛋白質測定測試盒(上海生工：Modified BCA Assay Kit，多糖的測定采用蒽酮硫酸法.

　　EPS分布的分析采用激光共聚焦掃描電子顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM).將從反應器中取出的樣品放置于液體的冷凍介質(Frozen Section Medium Neg-50，Richard Allan Scientific)中大約15~20 min，等待冷凍介質完全滲入樣品后，將其置于冷凍切片上快速冷凍.樣品污泥可以從赤道橫截面方向被切成不同厚度的薄片，也可完整地使用.本試驗使用被熒光染料Alxea-488(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)標記的稀釋比例為1 ∶ 10的金橙黃色孢盤菌凝集素熒光染色劑AAL-488(Vector，Bulingame，California，USA)對樣品污泥中EPS成分進行染色，該染色劑熒光的發射波長為488 nm.對于樣品污泥中的細菌成分，本試驗選用稀釋比例為1∶ 1000的核酸染料Syto 60(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA).被該染料染色后的細菌會發射出波長為633 nm的熒光.將染色后的樣品放置于一臺正置式型號為TCS SP的共聚焦掃描電子顯微鏡下進行觀察.EPS和細菌被染色后的熒光經過激發后分別在505~545 nm和大于650 nm的波長范圍內被捕捉和記錄.觀察使用的水鏡光圈為20×0.8 NA，掃描方向為XYZ方式，掃描圖像儲存為512×512像素圖片.

　　2.4 其它參數的分析方法

　　COD、氨氮、MLVSS、MLSS、SVI依照國家環保局《水和廢水監測分析方法》(第4版)進行測定;污泥外觀形態變化采用Motic公司的DMWB1-223PL型光學顯微鏡進行觀察，顆粒污泥強度的測定采用的測定方法.

　　3 結果

 　　3.1 污泥外觀形態變化

　　利用光學顯微鏡對接種污泥和反應器內的污泥外觀形態進行觀測和拍照.取運行24、33和72 d的污泥分別代表普通活性污泥期(簡稱“普通污泥”)、顆粒污泥形成初期(簡稱“顆粒初期”)和顆粒污泥形成穩定期(簡稱“顆粒穩定”)3個階段.其中，普通污泥期是指污泥以絮體形式存在，絮體的大小和形態由接種期開始的明顯變化直至相對穩定，且不具有顆粒化趨勢的時期;顆粒污泥初期是指小顆粒初步形成且有不斷增大的趨勢，但其周圍仍舊存在較多絮體的時期;顆粒污泥穩定期是指相較顆粒污泥形成初期，污泥顆粒明顯增大、規則致密，且顆粒的大小和形態相對穩定的時期.接種污泥和3個運行工況下典型污泥的外觀形態變化如圖 1所示.可以看出，接種的城鎮污水處理廠污泥主要是以細小絮體為主的普通活性污泥;SBR中運行24 d的污泥出現了一些大的并質輕的菌膠團，但大部分為絮體污泥;運行28 d后，減少了沉淀時間，輕質絮體污泥容易被洗出，顆粒污泥逐漸形成，第33 d的污泥已基本顆粒化，平均顆粒粒徑為200 μm;46 d后繼續減少沉淀時間，顆粒形成更趨于穩定，第72 d的顆粒污泥相對致密，平均粒徑達到335 μm，顆粒污泥的機械強度(以完整性系數計)為98.98%，與之前相關研究中的數據相近.

　　圖 1 SBR運行過程中污泥的外觀形態變化 (a.接種污泥;b.普通污泥,第24天;c.顆粒初期,第33天;d.顆粒穩定,第72天)

　　3.2 污泥濃度和沉降性能變化

　　反應器中混合液污泥濃度(MLSS)和污泥容積指數(SVI)的變化如圖 2所示.隨著反應器的運行，MLSS逐漸增加.在前期普通活性污泥法運行階段，MLSS緩慢增加至6.4 g · L-1左右.沉淀時間減少至10 min時，MLSS呈現快速上升趨勢;沉淀時間繼續降低至3 min，篩選出沉降速度慢、沉降性能差等不利于出水水質的絮體污泥，此時MLSS有所降低，而后又緩慢上升直至最后基本穩定在10 g · L-1左右.原接種污泥沉降性能差，SVI為123.2 mL · g-1，之后SVI的曲線一直呈現下降趨勢，直至第28 d，即沉降時間為10 min后，SVI迅速下降并漸漸穩定在50 mL · g-1附近，進一步將沉降時間縮短后，SVI隨運行時間的延長而繼續降低至40 mL · g-1附近.隨著好氧污泥顆粒化的進程，MLSS逐漸升高，SVI逐漸降低，說明了污泥濃度和沉降性能的提高.

　　圖 2 好氧污泥顆粒化培養中MLSS和SVI的變化

　　3.3 顆粒化前后污染物去除對比

　　顆粒化前后SBR典型周期中氨氮和COD的變化如圖 3所示.由圖 3可知，顆粒化前后氨氮去除率均接近100%.隨著氨氮快速降低直至為零，亞硝氮先增加后減少，硝氮逐漸增加，總氮基本呈現先快速下降后緩慢上升的趨勢.顆粒化前后COD均呈現先快速下降后略有上升再逐漸下降的趨勢，普通活性污泥的COD去除率為94.05%，好氧顆粒污泥的COD去除率為97.07%.可以看出，普通活性污泥和顆粒污泥在氨氮和有機物的去除方面幾乎沒有區別.

　　圖 3 普通污泥和顆粒污泥典型周期中氨氮、亞硝氮、硝氮、總氮和COD的變化

　　3.4 不同類型EPS的變化

　　顆粒化過程中總EPS、溶解性EPS、松散結合型EPS和緊密結合型EPS含量的變化如圖 4所示.曝氣末普通污泥、顆粒初期和顆粒穩定期污泥中總EPS含量分別為162.96、226.83和231.15 mg · g-1(以VSS計，下同)，這說明顆粒污泥總EPS均比普通污泥高.目前存在的胞外聚合物假說認為，胞外聚合物EPS能通過架橋等作用連接和粘附細胞，從而形成顆粒污泥.結合試驗結果表明，EPS在污泥的絮凝性和顆粒結構的穩定性方面都具有重要意義.溶解性EPS在普通污泥中數量極少，在顆粒初期污泥中為67.90 mg · g-1，占總EPS的31.48%，顆粒穩定污泥中為35.32 mg · g-1，占總EPS的22.60%，這表明顆粒污泥中溶解性EPS都高于普通污泥，且顆粒形成初期增長明顯.觀察圖 4可以得出顆粒化過程中存在松散結合型EPS，但相比總EPS，松散結合型EPS含量較低且變化幅度不大.曝氣初期，顆粒污泥中松散結合型EPS均高于普通污泥，隨著曝氣時間的延長，有下降的趨勢，在此過程中，松散結合型EPS是否被細菌利用、降解或轉化成其他物質還有待更進一步的研究.此外，曝氣末普通污泥中緊密結合型EPS為161.06 mg · g-1，占總EPS的98.83%.顆粒初期污泥中含有155.42 mg · g-1，占總EPS的68.52%，顆粒穩定期污泥中為178.92 mg · g-1，占總EPS的77.40%.不難看出，3類污泥中EPS含量均以緊密結合型EPS為主要成分.對比曝氣起點和終點緊密結合型EPS變化的幅度發現，普通污泥差值為50.27 mg · g-1，顆粒初期差值縮小為15.84 mg · g-1，顆粒穩定期進一步縮小為6.12 mg · g-1，這說明緊密結合型EPS含量在顆粒污泥系統中相對穩定，而普通污泥系統中的EPS受沉淀和厭氧期的影響較大，這可能是普通污泥沒有顆粒污泥更為密實結構的原因.

　　圖 4 顆粒化過程中總EPS、溶解性EPS、松散結合型EPS和緊密結合型EPS含量的變化

　　3.5 EPS中蛋白質和多糖的變化

　　顆粒化過程中蛋白質和多糖含量的變化如圖 5所示.普通污泥和顆粒污泥中蛋白質含量均高于多糖，是污泥EPS中的主要成分.對比曝氣周期終點，普通污泥中蛋白質為152.24 mg · g-1(以VSS計，下同)，占總EPS的93.42%，顆粒初期污泥中蛋白質為214.37 mg · g-1，占總EPS的94.51%，顆粒穩定期污泥中蛋白質為215.76 mg · g-1，占總EPS的93.34%.這說明顆粒形成初期蛋白質含量有明顯上升，而顆粒初期和顆粒穩定期污泥中蛋白質含量相差不多，較為穩定.觀察一個典型周期中蛋白質和多糖的變化趨勢可以發現，除了顆粒穩定污泥30 min處蛋白質含量的特例外，蛋白質和多糖的變化趨勢都是先降低后上升，這個特例的具體成因還有待進一步的研究分析.蛋白質和多糖在顆粒污泥中的含量都分別高于普通污泥中兩者的含量.同時隨著污泥的顆粒化，含量較少的多糖一直呈增長的趨勢.這 是因為胞外多糖本身為高分子粘性物質，可以作為細胞間連接和粘附的基質，促進微生物聚集形成并穩定顆粒的三維立體結構.研究發現，顆粒污泥形成過程中多糖含量會隨著剪切力的增加而急劇增加，認為EPS中多糖對顆粒污泥形成起著重要的粘結作用.且有研究表明，蛋白質比多糖更易與金屬離子通過靜電作用而鍵合，從而成為影響微生物聚集體形成的關鍵因素.因此，蛋白質和多糖都能促進微生物的聚集，有利于顆粒污泥的形成.

　　圖 5 顆粒化過程中蛋白質和多糖含量的變化

　　3.6 污泥中EPS分布的變化

　　圖 6分別為普通污泥時期絮體污泥、顆粒穩定期顆粒污泥表面和顆粒污泥內部縱斷面切片的CLSM圖.圖中紅色代表細菌，綠色代表EPS的分布.從圖可以看出，呈絮體和膠團狀的普通污泥，結構相對松散，體積微小，EPS和細菌的分布較為均勻，兩者交織粘接.污泥顆粒體積明顯變大，呈現規則球形，表面密實，顆粒表面分布著大量細菌和EPS，其中，細菌的分布面積大于EPS.污泥顆粒縱斷面顯示出細菌主要分布在顆粒的表面，在其內部細菌數量明顯減少，主要分布的是EPS.由于顆粒污泥有著比絮體污泥更大的體量和更致密的結構，在顆粒化的過程中，細菌分泌的EPS實際上成為細菌相互粘結的類似膠水的物質，有利于顆粒形成和增大.隨著顆粒粒徑的增加，顆粒污泥中基質傳遞的阻力也隨之增大，細菌不斷向表面遷移從而能獲得足夠的食物和氧，這可能是造成細菌和EPS分布變化的主要原因.

　　圖 6 普通污泥和顆粒污泥中細菌(紅色)和EPS(綠色)的分布變化 (a.普通污泥絮體表面，b.污泥顆粒表面,c.污泥顆粒斷面)

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　　4 結論

　　1)顆粒污泥相比普通活性污泥，反應器中的MLSS可達到10 g · L-1，SVI可達到40 mL · g-1，兩者COD和氨氮的處理效率近似.

　　2)普通污泥和顆粒污泥中蛋白質含量均高于多糖，是污泥EPS中的主要成分.顆粒形成初期蛋白質含量有明顯上升，一個典型周期中蛋白質和多糖的變化趨勢普遍是先降低后上升，蛋白質和多糖在顆粒污泥中的含量都分別高于普通污泥中兩者的含量.同時隨著顆粒化過程，含量較少的多糖一直呈增長的趨勢.

　　3)顆粒污泥中總EPS和溶解性EPS含量均高于普通污泥，且顆粒形成初期溶解性EPS增長明顯.顆粒化過程中存在松散結合型EPS，但含量較低且變化幅度不大.曝氣初期，顆粒污泥中松散結合型EPS均高于普通污泥，隨著曝氣時間的延長，有下降的趨勢.3類污泥中EPS含量均以緊密結合型EPS為主要成分，緊密結合型EPS含量在顆粒污泥中相對穩定.

　　4)CLSM圖像顯示，好氧污泥顆粒表面分布著細菌和EPS，其中心主要分布的是EPS.