如何對某個微生物菌種進行實時定量pcr

Real2time PCR)技術 ,是在 PCR反應體系中加入熒光基團 ,利用熒光信號累積實時監測整個 PCR進程 ,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術于 1996年由美國 AppliedBiosystems公司推出 ,通過對 PCR過程的實時監控 ,可專一、 靈敏、 快速、 可重復地精確定量起始模板濃度 ,真正實現了 PCR從定性到定量的飛躍。熒光定量 PCR技術以其獨特的優勢得到快速發展 ,這項技術已經廣泛應用于臨床和生命科學研究的各個領域。現就其在臨床微生物檢測方面作一概述。1　 熒光定量 PCR在檢測和鑒定中的應用1 . 1　 在病毒檢測和鑒定中的應用目前 ,熒光定量 PCR已用于多種病毒的檢測。Malmstrom等術對 185份不同基因型混合到一起的 B型肝炎病毒樣本進行檢測 ,能檢測到所有的基因型 ,以此證明該方法的高精確度。OkamotoTaqMan技術平臺。雷永良等對 172例臨床診斷手足口病患者的 324份標本進行人腸道病毒、 柯薩奇病毒 A組 16型和腸道病毒 EV71型核酸特異性的反轉錄檢測 ,同時進行熒光定量 PCR和 EL ISA法平行檢測 ,熒光定量 PCR方法的結果與反轉錄檢測一致 ,兩者的靈敏度均高于 EL ISA法 ,與傳統的 RT2PCR和 EL ISA相比 ,實時熒光定量 PCR檢測標本快捷 ,特異性強、 靈敏度高 ,檢測手足口病腸道病毒準確高效 ,值得推廣。秦萌等定量 RT2PCR 檢測方法 ,實現了同時檢測新甲型[1]采用四重 TaqMan熒光定量 PCR技[2]建立了風疹病毒的[3 ]設計的一種四重熒光 2011年 第 2期李春娟等 :熒光定量 PCR技術在臨床微生物檢測中的應用H1N1流感病毒、 人季節性 H1N1流感病毒和人季節性 H3N2流感病毒 ,該方法特異性強 ,靈敏度高 ,最低可檢測至 20個拷貝的 RNA。譚耀駒等[4]以人 3型腺病毒感染的細胞和常見的呼吸道消化道感染的病原體為研究對象 ,建立了人 3型腺病毒 TaqMan熒光定量 PCR檢測方法 , TCI D50細胞培養液中病毒核酸最低檢出稀釋度是 1026,且呼吸道和消化道感染常見的病原體未出現交叉反應。白志軍登革熱病毒 (DV) 1型 5′設計一套特異性引物和 TaqMan探針進行熒光定量PCR快速監測并應用于臨床診斷 ,在登革熱的早期診斷中有較高的敏感性、 特異性和重復性 ,可作為DV1的快速診斷方法。其他病毒如 A /C/E型肝炎病毒 DNA[2]、 EB 病毒[13 ]等熒光定量方法均有報道和建立。WHO 于2009年 4月 28日起草了 CDC protocol of Real2timeRT2PCR for influenza A (H1N1) ,詳細介紹了 TaqMan技術進行豬流感病毒檢測和分型的操作規程1 . 2　 在細菌檢測和鑒定中的應用近年來 ,由于傳統方法鑒別細菌的種種不足 ,Real2time PCR 技術已應用于多種細菌的檢測。Chandran等了檢測結合分枝桿菌的方法 ,與傳統的涂片染色法和培養法相比 , 其靈敏度為 97. 2% , 特異性達100% ,均高于兩種傳統方法。Tatavarthy等沙門氏菌的 ompF基因進行 Real2time PCR技術檢測 ,此方法能檢測沙門氏菌屬的所有種型 ,特異性為100%。