如何正確選擇的CRISPR文庫？

　　確認基因型和表型之間的關系是功能基因組學的最終目標。如今，功能基因組學有了一種強大的新工具，那就是CRISPR-Cas9文庫。這種方法利用慢病毒載體大規模導入全基因組sgRNA文庫，能夠同時靶向數千個基因，實現高通量的功能基因篩選。

　　大家最常用的Cas9靶定5’-NGG PAM位點，這種位點在人類基因組中平均每8 bp就出現一次，因此我們有大量的sgRNA可供選擇。不過，如何選擇？這才是關鍵。并非所有sgRNA的效果都相同，每個sgRNA的效率和特異性存在差異。這意味著設計最佳的sgRNA文庫并非易事。

　　幸好，市場上出現了一些設計好的文庫，能夠拯救水深火熱中的你。這些文庫避免了耗時的設計和驗證工作，且精心挑選的sgRNA有著最佳效率和生物學意義。不過，在選擇這樣的預設計文庫時，你還有一些因素需要考慮。

　　CRISPR-Cas9工具箱

　　在開展CRISPR-Cas9篩選時，首先需要選擇的是遺傳擾動的類型，這主要取決于你想解決的生物學問題。最常見的選擇是CRISPR-KO敲除文庫，其中Cas9蛋白在DNA上引入雙鏈斷裂，通過基于非同源末端連接（NHEJ）的DNA修復來引入移碼突變，從而破壞基因功能。這些文庫的sgRNA針對組成型表達的外顯子，并且通常靶向5’末端。

　　然而，基因敲除并非適用于所有場景。對許多疾病而言，正是基因表達的調控及相關的表型變化驅動了疾病的發展。因此，上調或下調基因可能更合適，而不是完全敲除基因，特別是在研究非編碼區和必需基因，或觀察不同表達水平下的表型變化時。

　　CRISPRi（CRISPR干擾）文庫將催化失活的Cas9（dCas9）與轉錄抑制因子相連接，干擾轉錄過程，導致基因knockdown。同時，CRISPRa（CRISPR激活）文庫將dCas9與轉錄激活因子（比如VP64或SunTAG）相連接，從而增強基因表達。選擇CRISPRa文庫意味著你不需要克隆和過表達感興趣的cDNA，即可實現全基因組范圍的功能獲得篩選。

　　每個基因需要多少個sgRNA？

　　CRISPR文庫須針對每個基因設計多個向導RNA，以確保每個目標都得到修飾，且結果具有統計學意義。每個基因的sgRNA數量越多（大約8-10個），可確保統計可靠性更高，有利于在初級篩選中鑒定表型較弱的基因。當然，這也意味著篩選工作量更大，成本更高。

　　減少每個基因的sgRNA數量（大約3-4個）將降低統計顯著性，但會產生較小的文庫，從而允許用較少的細胞進行篩選。這也意味著細胞培養的時間和成本比較低。這樣的文庫適用于數量有限的細胞（如原代細胞），可用于篩選多個模型且合并后開展測序，從而降低測序成本。

　　盡管早期的CRISPR篩選及相關的文庫都是全基因組范圍的，比如張鋒團隊構建的GeCKO文庫，但之后也涌現出形形色色的文庫，可關注特定的基因家族或生物學通路。例如，賽默飛世爾科技就提供了針對可成藥基因組、激酶、GPCR、轉錄因子等目標的19種文庫。

　　縮小篩選的范圍，減少目標的數量，這種操作有不少好處。首先，可增加每個基因的sgRNA數量，以提高統計置信度，并降低測序成本和后續分析的負擔。其次，還有望降低系統中的噪聲，檢測到可能被屏蔽的目標。

　　Tips：

　　? 一些CRISPR文庫在使用前需要擴增，但必須確保文庫擴增后的代表性

　　? 借助新一代測序可驗證文庫完整性，以及擴增后所有sgRNA都存在

　　? 一些文庫是以立即可篩選的慢病毒形式提供的

　　CRISPR文庫的形式

　　市場上銷售的CRISPR-Cas文庫是針對一般用途而設計的，而目標的選擇是基于基因組數據。由于基因組注釋在動態變化，文庫中的目標也在不斷更新。因此，盡管文庫是針對相同物種的，但不同文庫的篩選效果可能不同。在使用過程中，你可能需要某些優化。你可以先開展全基因組范圍的篩選，然后利用自定義文庫開展小規模的研究。

　　CRISPR文庫可以單質粒的形式提供，也可以雙質粒的形式提供，區別就在于Cas9的導入方式。在雙載體系統中，表達Cas9的質粒先導入，而sgRNA文庫后導入。如果Cas9采用了可誘導的啟動子，那么在sgRNA文庫導入后，細胞可快速表達高水平的Cas9，從而更快實現基因敲除。

　　原先，由于構建好的重組載體比較大，人們只能將Cas9和sgRNA放在不同的質粒上分別導入，以確保病毒滴度高。不過，如今也出現了單載體系統。好處就是可以少做一次轉染，節省時間和經費。

　　CRISPR-Cas9基因編輯系統的出現，為探索基因型與表型之間的關系提供了一種經濟而高效的方法。目前有這么多種預設計的文庫，可以幫助科學家跳過令人頭疼的設計工作，享用sgRNA設計算法的最新成果。不過，具體如何選擇，還是要好好斟酌一番。