實時熒光定量PCR技術（real-time fluorescent quantitative PCR，后文簡稱qPCR）作為目前核酸檢測和定量中最主要的分子生物學工具之一，以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、自動化程度高、速度快等多個優點在疾病快速檢測、食品安全檢測、靶向用藥基因檢測等多種應用領域中一直發揮著巨大的作用。
自2018年8月起，國內爆發非洲豬瘟疫情，非洲豬瘟具有多種表現形式，最常見的是急性發病形式，相關致死率高達 100%。非洲豬瘟嚴重威脅著養豬業的健康生產和相關供應鏈的發展，但目前還不存在有效的疫苗或治療方法，專業人員意識到僅靠傳統的臨床癥狀判斷，并不能有效的控制疫情，人們的目光越來越多的集中到了具有準確、靈敏、快速等優勢的實時熒光定量PCR技術。
qPCR作為一項成熟的實驗技術，實驗操作看起來也并不復雜，但知易行難，如何保證得到的檢測結果是真實有效的呢？這對于動物疾病檢測是至關重要的。俗話說，好的開始是成功的一半，成功的實時熒光定量PCR 設計和開發是獲取準確檢測數據的基礎。
一個成功的qPCR結果應該是穩定、可重復、準確、靈敏度高且特異性強。我們看到的最終qPCR結果是多個實驗要素綜合的輸出，熒光定量pcr實驗步驟中所有的實驗要素對于實驗成功缺一不可。qPCR實驗由這些相關要素組成：樣本、標準品、實驗對照、誤差校準、試劑選擇。
由于涉及點比較多，限于篇幅我們僅挑取兩個點展開討論。
實驗對照在很多時候并不被重視，因為大家往往會覺得對照并不必要，而且會增加實驗成本。但從長遠來看，所有的實驗對照都是為了確保得到的實驗結果是真實的。如果沒有合理的對照，實驗有效性將無法保證，并且在出問題的時候很難進行故障排除。
實驗對照可以分為兩大類，一類是陽性對照，主要用于排除假陰性結果的干擾；一類是陰性對照，主要是用于排除假陽性結果導致的誤判。
01.陽性對照
陽性對照可以監控反應體系中是否存在PCR抑制物，及反應系統 (包括試劑、PCR程序、熒光采集）是否正常。可以分為兩類內部陽性對照和外部陽性對照。內部陽性對照常規的選擇是內參基因，但在很多情況下，選擇合適的內參基因并非易事，這時通過引入外部陽性對照，可以起到同樣的監控作用。一個合適的外部陽性對照應該可以整合進任意的實驗設計中，且不會與待檢樣本的核酸序列產生交叉反應，同時不會成為檢測位點的競爭抑制劑。我司的VetMAX Xeno IPC經美國獸醫實驗診斷協會驗證，與現有GeneBank上任何物種無交叉反應，兼容多種類型及多重檢測的實驗需求。
02.陰性對照
陰性對照可以進一步細分為無模板的陰性對照 (No Template Control，NTC)、陰性樣品的對照 (Negative Sample Control，NSC)以及如果模板是RNA的話，還有一種未經反轉錄的對照（No Reverse transcript Control）。無模板的陰性對照是在反應體系中不加入核酸模板，而以水為替代的對照，主要用于監控配置反應體系中的相關組分是否存在污染；陰性樣品的對照則是在樣本提取過程中，用已知的陰性樣本或者水作為樣本進行提取，并將得到的提取物作為模板同樣進行qPCR檢測，可以監控整個實驗操作過程中是否存在污染。
當檢測模板是RNA的話，還需要先進行一步反轉錄得到cDNA之后才能進行后續qPCR反應。若是模板不純，混有基因組DNA可能會干擾后續結果，這時從未經反轉錄的對照的結果就能有效判斷擴增信號是來自合成的cDNA還是基因組DNA。
實驗污染防治
與傳統PCR一樣，實時熒光定量PCR反應也容易受到核酸污染，從而導致假陽性結果。上面我們提到了陰性對照可以幫助監控體系和實驗過程中是否存在污染。如果發現污染，接來下就是找到污染源并清除它。qPCR可能的污染源有：樣本間的交叉污染、實驗室設備的污染、前次PCR擴增產物和引物殘余污染。這是假陽性PCR結果的主要來源
前兩種污染可以通過嚴格規范的實驗操作有效清除，比如嚴格分區實驗室及嚴格遵守工作程序；進行合理的化學清污，如使用10%的次氯酸鈉清洗實驗臺面，然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸鈉；或者通過紫外線（UV）照射，每次實驗前可將實驗臺面照射5——20分鐘，來消除擴增產物遺留污染。當以上方法都無法有效去除污染時，還可以使用 DNAZap? PCR DNA 降解試劑，完全降解PCR靈敏度水平上的污染核酸。
但對于第三種污染，也是實驗中的主要污染源，以上這些方法就顯得有心無力了。針對第三種污染，可以采用尿嘧啶DNA糖苷酶（簡稱UNG酶）或者尿嘧啶DNA糖基化酶（簡稱UDG酶）來預防這類污染。UNG/UDG酶會選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成堿基缺失的DNA鏈。這些缺失堿基的DNA鏈在堿性介質以及高溫下會被進一步水解斷裂，最終被消除。UNG/UDG防止qPCR中殘余污染源于在qPCR預混液中用dUTP替代dTTP。在PCR擴增前，先用UNG/UDG處理后續的實時熒光定量PCR 反應預混液，降解其中污染的含有尿嘧啶的PCR產物，保留天然 (含有胸腺嘧啶) 的靶DNA模板用于后續的PCR擴增。賽默飛絕大部分的qPCR預混液中都加入了UNG/UDG酶，有效的控制DNA殘余污染對實驗結果的干擾。