實體瘤的CART細胞治療

　　簡介

　　嵌合抗原受體（CAR）含有一個細胞外單鏈可變區（scFv），其功能為標的、穿膜間隔、及細胞內信號或激活。CAR-T細胞將CAR通過質粒轉染、mRNA或病毒載體傳導引入T細胞以識別細胞表面暴露的癌相關抗原（TAA）。

　　迄今為止大約有30個TAA正在研究中，其中廣為關注的包括癌胚抗原（CEA）、神經節苷脂GD2，間皮素、白介素13受體α (IL-13Rα)、人表皮生長因子受體2（HER2）、成纖維細胞活化蛋白（FAP）、及L1細胞粘附分子（L1CAM）。其中較為樂觀的CAR-T臨床試驗包括GD2 CAR-T治療成神經細胞瘤、HER2 CAR-T治療肉瘤、及HER1 CAR-T治療肺癌。

　　CAR-T治療實體瘤主要面臨問題包括TAA特異性及可接觸性、抗原雜合性、細胞販運、惡劣腫瘤微環境（TME）、及T細胞內部調控通路。

　　標的抗原特異性問題

　　理想的TAA應具有腫瘤特異性與可接觸性，即在所有腫瘤表面有表達，且在正常細胞中無分布。此類TAA包括新抗原、癌胚或發育抗原、及腫瘤選擇抗原。表皮生長因子（EGFR）與糖蛋白為良好實體瘤標的物，如EGFR變體III（EGFRvIII）CAR-T治療成神經細胞瘤、MUC1 CAR-T治療乳腺癌、與MUC16 CAR-T治療卵巢癌。選擇性腫瘤抗原（TSA）如間皮素也具有潛力，目前進行的嘗試包括SS1抗體及指定P4。SS1 CAR-T有造成異常免疫毒性的潛在可能性。特異性同樣關系到CAR-T的安全性，如高親和力HER2 CAR-T可能造成致命后果。控制此風險的方式包括短效轉染的自限性CAR-T及自殺基因，如單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因或誘導胱天蛋白酶9（iCasp9）基因。其他增強特異性的方式還有同時識別兩個抗原以增強活性。

　　抗原雜合性問題

　　抗原雜合性即為單一腫瘤內抗原表達差異，其可能通過免疫編輯造成腫瘤逃逸。解決此問題的方式為CAR-T治療同時引導間接腫瘤殺傷，或觸發“抗原擴展”。間接殺傷可通過中性粒細胞、巨噬細胞、或自然殺傷細胞接觸CAR-T后釋放細胞因子實現。抗原擴展可通過CAR-T在免疫刺激微環境中殺傷癌細胞，并由樹突狀細胞將抗原呈遞給內源CD8細胞實現。EGFRvIII CAR-T治療小鼠腦瘤后，小鼠對EGFRvIII陰性腫瘤具有抗性；間皮素CAR-T治療間皮瘤后的患者出現新抗體反應。以上兩個實驗間接證明抗原擴展效應。對于抗原雜合性，目前有三種嘗試：1）篩選病人TAA，并僅收治TAA表達比例高于某閾值的病人；2）同時標的多個腫瘤抗原，例如B細胞白血病治療時將CD19及CD20同時作為靶點。標的多個抗原可以通過同一個CAR-T上表達兩個CAR、使用兩個CAR-T細胞株、或同一個CAR包含兩個不同scFv實現；3）增強CAR-T的腫瘤殺傷力，例如T細胞受體結合后釋放IL-12。然而，IL-12基因可能轉移至腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）中并導致嚴重毒性。嚴格控制IL-12或低毒細胞因子如I型干擾素可能緩解此問題。另一種提高CAR-T有效性的方式為釋放雙特異性抗體（BiTE）如抗CD3與腫瘤抗原Eph2A或CEA，其可激活內源性T細胞。

　　CAR-T細胞販運問題

　　CAR-T細胞販運至腫瘤細胞中遇到的困難大多由趨化因子/受體不匹配造成，如腫瘤CXCR3與CCR5配體表達量少時CAR-T細胞無法有效到達腫瘤位點。解決此問題的方式有1）使CAR-T表達配對性更好的趨化因子受體，如CCR2b可加強CAR-T在高CCL2腫瘤中的遷移，抑制CAR-T蛋白激酶A（PKA）可增強腫瘤浸潤性；2）攜帶趨化因子的癌細胞裂解病毒可吸引CAR-T至腫瘤位點，如CCL5腺病毒載體；3）腫瘤位點局部灌注CAR-T。局部灌注的潛在問題在于技巧要求過高，且CAR-T細胞很難離開腫瘤并通過血液循環販運至其他腫瘤位點。

　　腫瘤微環境（TME）問題

　　TME時常不利于CAR-T治療。腫瘤周圍常有物理基質及高組織壓，其可通過FAP CAR-T細胞或使CAR-T分泌可降解基質的酶進行破壞。TME大多為低氧及營養饑餓狀態，抑制了T細胞增殖及產生細胞因子，有時可能聚集Treg。改變關鍵CAR-T蛋白合成可能加強抗腫瘤活性。來源于腫瘤的可溶因子及細胞因子同樣可能降低CAR-T效能，如前列腺素E2（PGE2）、腺苷、TGFβ可抑制CAR-T增殖、降低CD4活性、及破壞CD8分化。抑制CAR-T的PKA基因、系統性阻滯TGFβ、或TGFβ陰性CAR-T可增強其抗腫瘤效能。除此以外，TME中存在各種免疫抑制細胞，如Treg、髓源性抑制細胞（MDSC）、及腫瘤相關巨噬細胞（TAM）或腫瘤相關中性粒細胞（TAN），其產生的TGFβ、PGE2、活性氧/氮、及精氨酸酶降低CAR-T效能。此外，TAM可大量表達程序性死亡分子配體1（PDL1），阻滯CAR-T活動，而MDSC可能召集Treg。清除GR1陽性細胞可提高CEA CAR-T控制直腸癌肝轉移能力；激活高F4/80 TAM使得CAR-T裂解卵巢癌；選擇性抑制Treg強化間皮素CAR-T作用。使用IL-2可加強CAR-T作用，但同時也誘導Treg增殖，因此使用內恒性細胞因子如IL-7或IL-21對CAR-T更有效。使用具有CD28胞漿區代替41BB胞漿區的CAR時應由其注意其大量釋放IL2。

　　T細胞內部調控機制問題

　　CAR-T激活時產生的表面分子如CTLA4及PD1可能對整體抗腫瘤效果有免疫拮抗作用。HER2 CAR-T或間皮素CAR-T聯合PD1阻滯都有顯著的腫瘤消退作用。PD1的抑制效果可通過將PD1的胞外區與CD28胞內區融合進行反轉。CTLA4抗體也可提高CAR-T效能。CAR-T激活后通過一系列細胞內負反饋停止T細胞活動，包括酶（如甘油二酯激酶）、磷酸酶（如SHP1）、泛素連接酶（如Cb1-B）、及轉錄因子（如Ikaros）。減少上述抑制劑，如甘油二酯激酶陰性，顯著增強CAR-T效能。其他限制CAR-T功能的細胞內部調控通路還有激活誘導細胞死亡，可通過使CAR-T表達抗凋亡蛋白減緩。

　　CAR-T實體瘤治療未來方向

　　CAR-T實體瘤下一步研究方向主要為淋巴細胞清除對CAR-T的加強作用及解決實體瘤屏障。目前人們正在嘗試替代CAR胞漿區，如ICOS、41BB、OX40、CD27、KIR2DS2，額外的基因編輯可為解決上述問題提供非常大的潛力。