1 導言
小RNA（miRNAs）是一種內源性非編碼蛋白的小分子RNA，它們是許多基礎的細胞過程中基因表達的主要調節因子，這些過程包括細胞增殖、細胞分化以及細胞凋亡等。miRNA在腫瘤生長過程中也發揮著重要作用。一般來說，miRNA通過控制翻譯過程來實現對目標蛋白表達的調控。然而，在靶向mRNA降解水平上的基因表達的調控已有報道。因此，有證據顯示miRNA能夠通過RNA降解來實現對細胞內mRNA濃度的直接調控，而且也會通過靶向作用于蛋白質級聯來調控mRNA水平，這些蛋白質級聯能夠調控下游轉錄或在轉錄后對mRNA水平進行調控。
在當前的研究中，我們重點關注miRNA hsa（人）miR-21，研究發現在乳腺癌和其他腫瘤中miR-21水平上調。更進一步的研究發現，miR-21在細胞凋亡和細胞生長過程中也發揮著功能性作用。為了進一步對miR-21進行研究，我們研究了miR-21的水平對三個假定的miR-21靶向基因（PDCD4，PTEN和TLR2）mRNA表達的影響（見圖1）。
圖1： 利用假定的miR-21靶向基因（PDCD4，PTEN和TLR2）的表達水平分析從而對has miR21進行分析的工作流程。
2 材料和方法
細胞培養
DMEM培養基中補充1%的L-谷氨酰胺，1%的盤尼西林/鏈霉素，10%的FBS，在+37℃ 5%CO2條件下培養HeLa細胞。用miRNA 21 miRIDIAN類似物，miRNA 類似物miRIDIAN對照，miRNA 21 mi RIDIAN抑制劑和miRNA miRIDIAN抑制劑對照siRNA（dhar-macon都為50nM），以及X-tremeGENE siRNA轉染試劑（羅氏公司），按照生產商的方案進行轉染。
RNA提取與逆轉錄
在轉染之后兩天，使用High Pure RNA Isolation Kit（羅氏公司），按照生產商的建議從HeLa細胞中提取總RNA（每個類似物miRNA三個生物學復制）。同時，使用High Pure miRNA Isolation Kit（羅氏公司），按照使用說明書上的指導，提取包含小分子量RNA在內的總RNA（兩個生物學重復）（見圖2）。按照生產商的指導，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（羅氏公司）和oligo（dT）18與隨機六聚體引物的混合物，按照每次反應500到1000ng總RNA的量進行第一鏈cDNA的合成。用miRCURY LNA First-strand cDNA Kit（Exiqon）進行miRNA 第一鏈cDNA的合成，每次反應使用4ng含有小RNA在內的總RNA。
圖2：用指定試劑（miRIDIAN miRNA類似物或miRIDIAN miRNA抑制劑）轉染HeLa細胞后，用Agilent生物分析儀對來自不同細胞集群的小分子量RNA進行凝膠電泳。