| 實驗步驟 | 眾所周知，在實驗室內和實驗室間難以保證雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳的重復性。在我們實驗室，強制性地要求嚴格遵守標準操作程序（sop ) , 以確保不同的操作者可以獲得可重復的分離結果。小麥白面粉樣品的 2D 膠圖譜示例如圖 16.1 所示。采用 Tris-CaCl2 提取法提取的并非“總蛋白”，而是小麥面粉中除谷蛋白之外的有代表性的蛋白樣品。如果提取總蛋白，由于谷蛋白的含量很高，可能會掩蓋掉其他較低豐度的蛋白質。同樣的問題也可能發生在其他含有高豐度蛋白的組織中，尤其是綠色組織中存在的二磷酸核酮糖竣化酶（Rubisco) 。
我們提供了三種方法。第一種是以使用 Tris-CaCl2 提取為特征的提取法，在我們實驗室被用于轉基因（GM ) 與非轉基因（non- GM ) 小麥的實質等同性的大規模蛋白質組學研究。第二種和第三種提取方法被廣泛用于文獻中，可適用于各種不同組織。
3.1 蛋白質提取
3.1.1 利用 Tris-CaCl2 緩沖液提取白面粉蛋白（參照 [ 11 ])
( 1 ) 2 g 白面粉加入 5 ml 預冷（4℃ ) 提取液，4℃ 攪拌 30 min。
( 2 ) 4℃，10000 g 離心 30 min，除去不溶物。
( 3 ) 保留上清于液氮中迅速冷凍，小份分裝，儲存于 -80℃，待用。
( 4 ) 用 Bradford 法測定蛋白質含量，以 BSA 作標準品。
3.1.2 酸 / 丙酮沉淀法提取白面粉或綠色組織蛋白（參照 [ 4 ] )
3.1.3 面粉
( 1 ) 在 50 ml Falcon 離心管中，懸浮 5 g 面粉于 20 ml 溶液 I 中，以最大速度渦旋 2 min，-20℃ 靜置 1 h。
( 2 ) 4℃，15000 g 離心 10 min。
( 3 ) 棄上清，加 5 ml 溶液II 渦旋以重懸沉淀。
( 4 ) 4℃，15000 g 離心 10 min。
( 5 ) 重復步驟 3、4 兩次。
( 6 ) 棄上清，在通風櫥中，連續氮氣流下干燥沉淀（確保無樣品損失）。
( 7 ) 用 1 ml pH 適宜的復水緩沖液重懸 40 mg 干燥樣品，渦旋 5 min，室溫 13000 g 離心 10 min。
( 8 ) 保留上清，小份分裝。在液氮中迅速冷凍。
( 9 ) 儲存于 -80℃。
( 10 ) 用前測定小份樣品的蛋白質濃度。
3.1.4 綠色組織
( 1 ) 使用預冷的研缽和研棒，液氮中研磨速凍的葉片。
( 2 ) 用 20 ml 溶液 I 懸浮 2 g 葉片粉末，以最大速度渦旋 2 min，-20℃ 沉淀 1 h。
( 3 ) 4℃，15000 g 離心 10 min，棄上清。
( 4 ) 加 5 ml 溶液II，渦旋重懸沉淀，4℃，15000 g 離心 10 min。
( 5 ) 重復步驟 4 兩次，在通風櫥中，連續氮氣流下干燥沉淀，確保無樣品損失。
( 6 ) 用 1 ml pH 適宜的復水緩沖液重懸 20 mg 干燥樣品。
( 7 ) 渦旋 5 min , 室溫 13000 g 離心 5 min。
( 8 ) 保留上清，小份分裝。液氮中迅速冷凍，儲存于 - 80℃ 備用。
( 9 ) 用前測定小份樣品的蛋白質濃度。
如提取的蛋白中有葉綠素污染，可嘗試 PEG/MgCl2 沉淀法（見注 3 ) 。
3.1.5 奧斯本分級分離法（ 參照 [ 12 ] )
( 1 ) 100 mg 面粉加 1 ml 水飽和正丁醇，室溫下攪拌 1 h。
( 2 ) 室溫下 5000 g 離心 10 min , 去上清。這是一個可選的步驟，用于“ 除脂”。
( 3 ) 抽提 “白蛋白/球蛋白” ：沉淀（來自步驟2 ) 加 1 ml 0.5 mol/L NaCl，室溫下攪拌 1 h。如上述步驟離心，保留上清并重復抽提。
( 4 ) 合并上清，采用 5%（V/V）乙酸在 4℃ 充分透析 48 h，期間至少更換 4 次透析液，每次 5 L。
( 5 ) 抽提 “醇溶蛋白”：沉淀（來自步驟3 ) 加 1 ml 70%（V/V）乙醇室溫攪拌 1 h。如前所述離心。保留上清并重復抽提。
( 6 ) 合并上清，5%（V/V）乙酸（至少更換 4 次，每次 5 L 溶液），4℃ 充分透析 48 h。
( 7 ) 抽提 “谷蛋白”：沉淀（來自步驟 5) 加 1 ml 50%（V/V）丙醇/2%（V/V）β-巰基乙醇/1%（V/V）乙酸，室溫攪拌 1 h ( 注意：如有需要，可直接用 DTT 代替 β-巰基乙醇）。如前所述離心，保留上清并重復抽提。合并上清，5%（V/V）乙酸（至少更換 4 次，每次 5 L 溶液），4℃ 充分透析 48 h。
( 8 ) 透析后，凍干所有溶液。
( 9 ) 最終的沉淀（來自步驟 7 ) 可用 1 ml “總蛋白提取緩沖液” （IEF 復水液）提取：室溫下混合抽提 1 h。如前所述離心，保留上清。分成小份，液氮中迅速冷凍，儲存于 -80°C 。
3.2 等電聚焦（IEF)
各種長度（如 7 cm、13 cm、18 cm、24 cm ) 和不同 pH 范圍的固定化 pH 梯度 ( IPG ) 膠條可供使用。IPG 膠條常在 20℃ 下（溫度低于 20℃ 可導致尿素結晶）于適量水化液中水化過夜（16 h ) 。這可在溶脹托盤 （ re-sweling tray ) 或直接在膠條槽（stripholder) 內完成。無論選取何種方法，必須保證膠條和容器底部間的氣泡都被移除。該步完成后，膠條需覆蓋上不導電的油。如果水化是在溶脹托盤內進行的，還必須轉移到膠條槽上運行。IEF 參數設置取決于膠條長度 ，但始終在 20℃ 完成。若溫度高于 20℃，可能導致蛋白質修飾，如尿素產生的 氰酸銨（ammoniumcyanate) 導致的氨甲酰化 ( carbamylation ) 。一旦等電聚焦完成，瀝去多余的覆蓋油，儲存膠條于 -80°C 。本說明假定使用的儀器是 GE Healthcare IPGphor。
膠條水化
( 1 ) 對于 24 cm IPG 膠條：融化 4 ml 水化液，加入 DTT 和 IPG 兩性電解質至以下濃度：DTT 40 mmol/L；兩性電解質 0.5%（V/V）。
( 2 ) 對于 pH 3~10 的 IEF，加入適量的樣品至水化液中，使每根膠條上樣 400 μg 蛋白質。理想條件下每根膠條須用 50~100 μl 樣品。對于 24 cm 膠條，蛋白質樣品和水化液的總體積應為 450 μl。理想條件下水化液：樣品比例不應小于 3:1。
( 3 ) 無論水化是在 IPG Manifold ( 多功能盤）還是直接在單根膠條槽內進行，用移液器從 24 cm、12 道槽的溶脹托盤（reswelling tray ) 的槽一端加入 450 μl 緩沖液和蛋白質混合液（見注 4) 。
( 4 ) 對于 pH 6~11 間的 IEF，除了兩性電解質以 pH 6~11 代替 pH 3~ 10 外，所用蛋白質和緩沖液的總體積與 pH 3~10 —樣。此外，水化液是從槽一端加入，樣品單獨加在正極端（+ ) 。
( 5 ) 放置干膠條（ ImmobilineDryStrip )，膠面朝下，置于溶脹托盤的槽中，確保膠條下無氣泡。
( 6 ) 用 DryStrip 覆蓋油覆蓋，加蓋封上，20℃ 水化 16~18 h ( 過夜）。
( 7 ) 取走膠條（使用鑷子），去除多余覆蓋油。
( 8 ) 膠面朝上，放入 24 cm IPGPhor Manifold 多功能盤中（ 最多可達 12 根） 。
( 9 ) 將膠條排列在每個槽的中間，以 DryStrip 覆蓋油覆蓋。即使未使用，也要將所有槽內填入覆蓋油。
( 10 ) 潤濕電極濾紙片，吸去多余水分。
( 11 ) 將電極濾紙片置于膠條的兩端，輕微接觸膠條。
( 12 ) 將可移動電極固定于 24 cm IPGPhor Manifold 多功能盤中。將電極置于濾紙片與膠條接觸部分。
( 13 ) 固定好電極位置，蓋上 IPGPhor 電泳儀的蓋子。
( 14 ) IEF 運行的條件必須根據不同的提取物憑經驗決定。但以下參數適用于面粉 /Tris - CaCl2 法提取物：500 V 、1 h；1000 V、1 h；8000 V、8.20 h。總計 65500 Vh。
( 15 ) IEF 結束后，移出膠條，除去多余覆蓋油，將膠條置于 10 ml 塑料吸管中 ( 去掉尖端使膠條能放入）。用封口膜密封，儲存于 -80℃。
3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)
3.3.1 使用儀器為 GE Healthcare Ettan Dalt II
( 1 ) 玻璃板用清潔劑浸泡過夜，去離子水沖洗，再用乙醇和 RO ( 反滲透）水沖洗，風干。
( 2 ) 根據使用說明書將凝膠板組裝（見注 5 關于硅密封膠的使用，如果使用的是非自封的膠板，確保膠板四周完全密封）。
( 3 ) 制備多塊膠時，在每塊凝膠盒間用可重復使用的塑料墊片隔開，將凝膠盒裝入制膠盒。保證凝膠盒緊密填充，且通過用硅脂涂抹橡膠密封墊使前板與灌膠盒形成完好密封。擰緊面板上的螺栓，水平放置灌膠盒。
( 4 ) 接上制膠管和漏斗，用夾鉗和立架保持垂直。
( 5 ) 如使用取代液，漏斗準備就緒后加入 100 ml 替換液至平衡室。如果不使用替換液，在灌膠后可通過用大量 熱水從管內沖走聚合的丙烯酰胺。
( 6 ) 12 塊 10% 的凝膠使用 1 L 凝膠溶液：250 ml 1.5 mol/L Tris - HCl，pH 8.8；333 ml 30% ( V/V ) Duracryl 0.65% (m/V ) bis；407 ml 水。攪拌，置于 2 L 布氏燒瓶中除氣 15 min。
( 7 ) 加入 10 ml 10% (m/V) SDS，稍加攪拌。
( 8 ) 用前加入 2.5 ml 10% APS 和 0.5 ml TEMED，攪拌。
( 9 ) 將丙烯酰胺溶液灌入漏斗，不斷補足（重要的是不能使漏斗中溶液完全流空，否則會在膠內形成氣泡）。持續加液直至膠面離第一塊前板頂端 1~2 cm ( 約 1 L ) 。
( 10 ) 移去漏斗，使替換液向下流入灌膠模具（caster ) 底部的 V 形槽。
( 11 ) 在每塊膠頂端覆蓋 1 ml 水飽和正丁醇，放置 3~4 h 待凝膠聚合。
( 12 ) —旦聚合完成，拆除灌膠盒，移去凝膠盒，用去離子水漂洗凝膠盒以去除水飽和丁醇，以及少量附著在凝膠盒外面上的小塊凝膠。
( 13 ) 配制 1 : 4 ( RO 水）稀釋的 1.5 mol/L Tris-HCl ( pH 8.8 ) 作為凝膠存儲液使用。
( 14 ) 將凝膠置入一個大的塑料盒，加入足夠的凝膠存儲液以完全覆蓋凝膠。
( 15 ) 凝膠在 2~4℃ “成熟” 10~14 天之后可供使用，但從制膠之日起一個月以后不能再用。
3.3.2 凝膠電泳
( 1 ) 每根 IPG 膠條用 10 ml 凍存的預制平衡液，在 4℃ 冰箱或冷室解凍過夜。
( 2 ) 準備 7 L下槽液：25 mmol/L Trizma 堿，15 mmol/L 冰醋酸。
( 3 ) 將緩沖液倒入 Ettan Dalt ll 槽，打開泵冷卻到 15℃。
( 4 ) 準備上槽液：3 L 200 mmol/L Tris 堿，0.4% (m/V) SDS，200 mmol/L Tricine。
( 5 ) 用水沖洗 IPG 膠條去除多余覆蓋油，在含 1% (m/V) DTT 的 10 ml 平衡液中平衡 15 min。
( 6 ) 棄去平衡液，再加入 10 ml 含 4% (m/V) 碘乙酰胺的平衡液溫育 15 min。由于碘乙酰胺感光，管子外要包上鋁箔。
( 7 ) 將第二向膠從冷藏處取出，用上槽液清洗凝膠頂端 3 或 4 次。
( 8 ) 向凝膠盒槽內填灌上槽液，并加載膠條。按慣例，膠條的酸性端是在凝膠的左邊。確保膠條和凝膠間沒有氣泡存在。
( 9 ) 潤濕凝膠盒邊緣，以順利穿過橡膠密封管的通路，將凝膠放入電泳槽。如果不足 12 塊膠，則使用 Perspex空白。
( 10 ) 加入上槽液，避免影響凝膠盒槽，蓋上蓋子，使用以下參數運行： 第 1 步：恒功率= 60 W ( 5 W/膠）；時間 0.15 h；溫度 = 15℃；泵 = 自動。第 2 步：恒功率=120 W ( 10 W/膠）；時間 2 h；恒功率 = 240 W ( 20 W/膠）；時間 6 h；溫度 = 15℃；泵 = 自動。
( 11 ) 當染料前沿離膠底端 0.5~1.0 cm 時停止電泳。總的運行時間約 8 h。
( 12 ) 撬開玻璃盒，每塊凝膠切角以指示方向。將凝膠置入合適的染液（ 見后述 ）。
3.4 凝膠染色
為了用蛋白質組學研究 2D 膠上蛋白點，染色必須與質譜分析兼容，且靈敏度越高越 好。符合這些標準的染色法有好幾種可供使用，包括膠體考染、某些銀染和各種熒光染劑，如 Sypro Ruby、Orange、Deep Purple 和 Flamingo。膠體考染靈敏性不如銀染和熒光染料，但是便于使用且相對便宜（見注 6 關于靈敏度部分）。銀染是一種多步式的過程，但能使較低豐度蛋白顯現。然而，由于沒有終止點，高豐度蛋白 可能會過度著色。同時，銀染的重復性可能不佳，因為染色程度取決于操作者。所有染色過程都需要在振蕩器或搖床上進行，在染色/脫色過程中提供溫和的振蕩。
3.4.1 膠體考馬斯亮藍 G250
( 1 ) 在 50%（V/V）甲醇、10%（V/V）乙酸（或 TCA ) 中過夜固定凝膠。
( 2 ) 在膠體考馬斯染料中染色（按照使用說明書用甲醇稀釋）（Bio- rad；4 : 1 染料：甲醇）。
( 3 ) 用 25%（V/V）甲醇，7%（V/V）乙酸脫色 1~5 min。
( 4 ) 用 25%（V/V）甲醇脫色過夜，保存在水中。
3.4.2 銀染（參照 [ 13 ])
( 1 ) 凝膠用 40%（V/V）乙醇、10%（V/V）乙酸（或 TCA）固定 30 min。
( 2 ) 置于“敏化液” 中 30 min：30%（V/V）乙醇，0.2% (m/V) 硫代硫酸鈉 ( sodium thiosulphate ) ，0.5 mol/L 乙酸鈉。
( 3 ) 用蒸餾水洗三次，每次 5 min。
( 4 ) 加入銀溶液 [ 0.25%（m/V）硝酸銀]，染色 20 min。
( 5 ) 用蒸餾水洗兩次，每次 1 min。
( 6 ) 置于“顯影液” 中：0.24 mol/L 碳酸鈉，每升溶液加 200 μl 37% 甲醛 ( 0.0074% 終濃度）。
( 7 ) 溶液變得混濁或 10 min 后加入新鮮顯影劑。繼續顯影直到達到所要求的染色程度。
( 8 ) 加入 0.04 mol/L EDTA 10 min 終止反應。
( 9 ) 用蒸餾水洗兩次。
( 10 ) 保存在水中。
3.4.3 Sypro Ruby 蛋白染色
( 1 ) 膠用 40%（V/V）甲醇，10%（V/V）TCA 固定過夜（18 h ) 。
( 2 ) 用 Sypro Ruby 染料在暗處染色過夜。Sypro Ruby 是光敏感的，所以凝膠需要在暗室中處理，凝膠儲存盒要蓋上鋁箔。
( 3 ) 凝膠用 10%（V/V）甲醇、6%（V/V）TCA 脫色。
( 見注 7 關于 Sypro Ruby 的使用和廢液處理）
3.5 凝膠成像與分析
有不同廠商的成像系統可供使用。掃描儀必須具有高分辨率，如需進行凝膠斑點質譜分析，掃描儀還要與切點儀（spot picker) 結合。
同樣的，有許多軟件包可供使用，允許凝膠匹配，產生合成（或參照）凝膠。 斑點體積、峰高和峰面積也可通過不同程序包獲得，因而能對處理進行比較。有必要進行進一步的數據分析，如主成分分析（PCA ) ，所以膠分析程序包所得的數據必須能轉換成 Excel 數據表，并與統計軟件包兼容。
3.6 酶解前膠塊脫色 （參照 [ 14 ])
3.6.1 對于考馬斯和 Sypro Ruby 染色凝膠塊
( 1 ) 在水中浸置 15 min，棄去水，繼續在 50 : 50 的水：乙腈中再浸置 15 min。
( 2 ) 重復上述清洗步驟。
( 3 ) 倒去所有液體，用乙腈覆蓋膠塊 5 min，此時膠塊應該不透明并脫水。
( 4 ) 棄乙腈，加入 0.1 mol/L NH4CO3，使膠塊再水化，放置 5 min。
( 5 ) 加入乙腈使乙腈：NH4CO3 比例為1 : 1，孵育 15 min。
( 6 ) 棄液體，抽真空離心使之干燥。
3.6.2 對于銀染膠塊
( 1 ) 將膠塊放入“ Farmer’ s 還原劑” [20% (m/V) 硫代硫酸鈉、1% (m/V) 鐵氰化鉀與水 1 : 1 : 1 混合 ] 直到膠塊完全干凈。用水沖洗。
( 2 ) 棄液體，抽真空離心使之干燥。
3.7 還原和烷化（參照 [ 14 ])
( 1 ) 膠塊在 10 mmol/L DTT、0.1 mol/L NH4HCO3 中，56°C 浸置 45 min 使之泡脹。倒去多余液體，迅速換以 55 mmol/L 碘乙酰胺、0.1 mol/L NH4HCO3，室溫，暗處孵育 30 min。
( 2 ) 棄去碘乙酰胺溶液，用 1 : 1 乙腈：0.1 mol/L NH4HCO3 清洗膠塊 15 min。
( 3 ) 棄液體，抽真空離心使之干燥。
3.8 酶解
胰蛋白酶膠內消化（參照 [ 14 ]) :
( 1 ) 加入足量的胰蛋白酶溶液，剛好覆蓋膠塊，冰浴 45 min 使之泡脹。
( 2 ) 棄去多余液體，加人 25 mmol/L NH4HCO3/5 mmol/L CaCl2，剛好覆蓋膠塊。
( 3 ) 37℃ 溫育過夜。
( 4 ) 肽段分離：快速離心收集消化物到底部，加入最小體積 25 mmol/L NH4HCO3，室溫孵育 15 min。
( 5 ) 加入等體積乙腈，混勻，室溫下孵育 15 min。
( 6 ) 收集上清，再用 5%（V/V）甲酸：乙腈（1 : 1 ) 重復抽提兩次。
( 7 ) 合并上清，抽真空離心使之干燥。
3.9 利用 Zip Tips 為質譜分析進行多肽除鹽和濃縮
3.9.1 MALDI - MS
( 1 ) 10 μl 0.1% (V/V) TFA 重懸消化物。
( 2 ) 10 μl 50: 50 乙腈：水潤濕吸管尖，重復兩次。
( 3 ) 10 μl 0.1% ( V/V) TFA 平衡管尖，重復兩次。
( 4 ) 上下吸抽 10 次將樣品吸入管尖（將多肽吸附到 tip ) 。
( 5 ) 0.1% TFA 清洗管尖。
( 6 ) 用 4 μl 50:50 乙腈：水，0.1% TFA 洗脫。
3.9.2 ESI-MS ( 參照 [ 15 ])
( 1 ) 10 μl 含 1% (V/V) 甲酸的 4%(V/V) 甲醇重懸消化物。
( 2 ) 10 μl 1% 甲酸潤濕吸管尖，重復兩次。
( 3 ) 上下移液 10 次進行蛋白質消化。
( 4 ) 用 10 μl 0.1% (V/V)甲酸清洗管尖。
( 5 ) 用 4 μl 含 1% ( V/V ) 甲酸的 70% (V/V) 甲醇洗脫。
3.10 MALDI 靶板點樣
( 1 ) 1 μl 消化物與 1 μl 基質混合。
( 2 ) 點樣于 MALDI 靶板，室溫下風干。 展 |
|---|
