將基因轉移至未分化ES細胞實驗——ES細胞電穿孔

線性化轉移基因 DNA未分化 ES 細胞

電穿孔儀和電穿孔杯neoR-MEF 滋養板ES 生長培養基

1. 準備下列試劑和材料：

線性化轉移基因 DNA（1 mg/ml，溶于無菌 TE）

未分化 ES 細胞

Bio-Rad 電穿孔儀和電穿孔杯

100 mm neo^R-MEF 滋養板

ES 生長培養基

含 300 μg/ml G418 的 ES 生長培養基

2. 收獲未分化 ES 細胞，以 10⁷ /ml 懸于 ES 生長培養基。

3. 吸取無菌 DNA 加入電穿孔杯。加入 0.8 ml ES 細胞，輕輕吹吸混合，不要產生氣泡。

4. 室溫電穿孔 DNA/細胞混合物：250 μF，0.3 kV。

5. ES 生長培養基 1:10 稀釋電穿孔細胞，接種 neo^R-MEF 滋養層，密度為 10⁶ 細胞/100 mm 滋養板。放于 37℃ 濕潤的 5% CO₂ 溫箱。

6. 接種 48 小時后，換含 300 μg/ml G418 的培養基。

7. 隔天換液。