小分子藥物單克隆抗體制備

在單克隆抗體制備中，首先進行的就是抗原的設計與合成，這是制備單抗成功與否的關鍵。因為產生抗體的特異性與親合性是與抗原密切相關的，合成的抗原如果可以將所需要的抗原決定簇充分暴露出來，那么機體更容易識別抗原決定簇，從而免疫的動物所產生的抗體自然會在特異性和親合力上最大程度的與抗原決定簇擬合。所以，在制備單抗的過程中，設計并合成抗原尤為重要。
 
對于小分子藥物抗原的設計與合成，論壇里已經有很多朋友進行了討論和交流，下面，我再將自己所了解的結合戰友們的經驗，作以下總結，由于能力有限，有總結的不到位的地方，還請戰友們指出來，不足的地方，大家一起討論補充。
 
一、完全抗原的設計
 
大家都知道，完全抗原的合成主要是在半抗原的基礎上連接上蛋白質形成的，主要原因在于，半抗原屬于小分子藥物，只有反應原性，但不具有免疫原性，只有與載體（通常為蛋白質，也有多肽）偶連后形成完全抗原，才具有免疫原性，進入動物體內后才會產生抗體。對于半抗原而言（大多數為小分子藥物），不同種類藥物有不同的空間結構，究竟如何設計合成完全抗原呢？
 
1、分析藥物結構
 
以磺胺對甲氧嘧啶（SMD）為例，磺胺藥物的母體為對氨基苯磺酰胺，大部分的磺胺藥是在N1端連接了取代基，N4端為氨基。也就是說各種藥物由于 N1端取代基的不同從而具有不同的活性，那么對于制備抗SMD的抗體而言，其抗原的合成就可以選擇在N4端連接蛋白，將N1端的對甲嘧啶環暴露出來，這樣免疫后就可以使機體產生針對SMD的抗體。如果是在N1端連接，那么半抗原突出的是磺胺類藥物共有的對氨基磺酸母核，這樣制備出的抗體其交叉性就會較大，更易識別磺胺類的其他藥物了。
 
所以，在設計之前應該認真分析需要合成的抗原結構，找出起抗原活性的位置及其抗原決定簇的位置。
 
2、設計合成的原則
 
免疫半抗原設計的基本原則是免疫半抗原與載體連接后在結合抗原中能最大程度保持和突出待測物的特征結構，特別是立體結構。
 
3、“間隔臂”
 
免疫半抗原一般有幾結構組成：待測物特征結構、用于連接特征結構和載體的間隔分子和末端的活性基團。間隔分子又稱為”間隔臂“。免疫系統對位于載體遠端的半抗原部分識別能力最強，所以間隔臂的位置選擇十分重要。間隔臂的位置結構最能體現一種免疫半抗原的設計意圖。一般我們可以直接利用待測物中非特征的結構部分作為間隔臂或自行構建間隔臂。通常間隔臂為非極性，除供偶連合成的基團外不應含有其他高免疫活性的結構，如苯環、雜環、飽和鏈烴等。
 
有的人認為，引入間隔臂對抗體的產生反而有干擾，假若間隔臂較長，或立體結構較特征性，則很容易產生針對間隔臂的“橋抗體“，在單抗的篩選過程中會產生干擾。但是，有的藥物由于分子量小、空間結構簡單，很難通過單純的連接蛋白產生高效特異的抗體，所以，引入間隔臂會有利于抗體的產生。
 
二、完全抗原的合成
 
常用的載體蛋白中，供連接的主要基團為游離氨基、游離羧基、酚基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基、精氨酸的胍基等。但由于蛋白質載體參與反應的基團差不多相同，所以連接方法主要取決于半抗原活性基團種類。
 
1、含羧基的半抗原
 
主要有混合酸酐法、碳二亞胺法、N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法（NHS）。該法的優點在于不含有間隔臂，可以排除“橋抗體“的產生。
 
2、含氨基的半抗原
 
有戊二醛法（含有戊二醛，容易產生“橋抗體“）、重氮法（不含間隔臂）。
 
3、含羥基的半抗原
 
主要有琥珀酸酐法、鹵代羧酸法。
 
此外，還有含巰基、醛基或酮基、硝基的半抗原，其偶連方法這里不再贅述，大家可以參考洪孝莊的《蛋白質連接技術》。、
 
三、完全抗原合成的鑒定
 
可以采用紫外分光光度法、紅外光譜法和免疫實驗的方法來進行鑒定偶連反應是否成功。
 
半抗原結合比的計算：即指半抗原與載體的連接比。一般認為，半抗原結合比過高或過低均影響抗體生成，以5-15為宜。但，有些研究者的實驗結果表明，半抗原結合比的大小對誘導抗體產生無決定性的影響。可以通過反應原料中蛋白質與半抗原的摩爾比和溶液的PH來控制結合比。
 
半抗原結合比=（ε結合物-ε載體）/ε半抗原
 
（ε為某波長的摩爾吸光系數，取載體、半抗原和結合物均有較強吸收時的波長；ε載體、ε半抗原可預先用純品檢測得到）