張麗華發文：N磷酸化修飾蛋白質的富集和鑒定方法

　　摘要

　　蛋白質磷酸化修飾在細胞的信號轉導、代謝、發育等生命過程中發揮著重要作用。除了研究較為透徹的發生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸側鏈羥基的O-磷酸化修飾之外，近年來，發生在組氨酸、精氨酸和賴氨酸側鏈氨基的N-磷酸化修飾受到了越來越廣泛的關注。然而，由于N-磷酸化修飾具有獨特的P-N鍵結構，導致其化學穩定性差。尤其是在O-磷酸化肽段富集常用的酸性條件下，N-磷酸化極易丟失。因此，目前對N-磷酸化蛋白質的研究仍處于初始階段。該文針對蛋白質N-磷酸化修飾的特點、富集和鑒定方法進行了綜述，并對其發展前景進行了展望。

　　自1906年被首次報道以來, 蛋白質磷酸化修飾作為關鍵調節因子受到了越來越廣泛的關注。到目前為止, 發現約有30%的人類蛋白質可能在某些時刻被磷酸化, 約500種蛋白激酶和少量的蛋白磷酸酶調節著磷酸化過程。同時, 蛋白質的磷酸化能夠影響諸多生理過程, 包括免疫反應、內分泌作用、神經機制和行為、胃腸道行為和肌肉骨骼調節等。此外, 由于激酶或磷酸酶突變導致的異常磷酸化會引起一些信號通路的異常, 成為某些疾病發生的誘因。

　　除了眾所周知的蛋白質O-磷酸化修飾, 即磷酸化發生在絲氨酸(pSer)、蘇氨酸(pThr)和酪氨酸(pTyr)的側鏈羥基上外, 還有一類發生在堿性氨基酸——組氨酸(pHis)、精氨酸(pArg)和賴氨酸(pLys)的側鏈氨基上, 稱為N-磷酸化修飾。由于其在信號轉導方面發揮重要的生物學功能, 越來越受到人們的關注。然而, 由于其特殊的化學不穩定性質, 目前針對蛋白質N-磷酸化修飾的研究仍處于初級階段。本文針對蛋白質N-磷酸化修飾的特性與功能, 以及富集和鑒定方法進行了綜述。

　　01特性與功能

　　與O-磷酸化修飾中的P-O鍵相比, N-磷酸化修飾中的P-N鍵水解的吉布斯自由能(ΔG°)較高。例如pHis的氨基磷酸酯鍵水解釋放的能量(ΔG°為-12.0~-13.0 kcal/mol)約為pSer、pThr或pTyr的磷酸酯能量(ΔG°為-6.5~-9.5 kcal/mol)的兩倍, 因此熱力學穩定性較差。此外, 氨基磷酸酯在動力學上也不穩定。氮原子的孤電子對和磷酰胺π鍵重疊較少, P-N鍵不能形成像P-O鍵一樣穩定的電子離域結構, 因此在酸性條件下P-N鍵的氮的質子化促進了磷酰基的解離, 從而容易發生去磷酸化。N-磷酸化修飾的不穩定性給其分析帶來了巨大的挑戰。

　　在蛋白質N-磷酸化修飾中, pHis是研究最為成熟的。根據咪唑環上磷酸化位置的不同, pHis具有1-pHis和3-pHis兩種異構體。Boyer等最先在大鼠肝線粒體中發現了pHis蛋白質。盡管在原核細胞中pHis修飾的豐度(約6%)高于pTyr(約1%), 但哺乳動物中有關pHis的報道較少。哺乳動物的第一個磷酸化組氨酸磷酸酶直到2002年才被鑒定。現有研究表明, pHis在細菌、真菌和植物中的雙組分和多組分磷酸信號傳導途徑中起主要作用。隨著生物化學和質譜技術的發展, 人們發現pHis對哺乳動物很多細胞生命過程, 如信號傳導、染色質組裝和離子傳導等, 都有重要影響。目前已知NME1和NME2是哺乳動物的兩個pHis激酶, 而LHPP是對應的pHis磷酸酶。

　　與pHis類似, pArg主要存在于細菌等原核生物中。在1994年對蛋白質精氨酸激酶McsB進行分離和鑒定后, Wakim等首次證實了原核生物中pArg的存在。2009年, Clausen等發現McsB在枯草芽孢桿菌轉錄調節中具有重要作用。隨后, 最初被認為是pTyr磷酸酶的YwlE被發現為pArg磷酸酶, 在細菌和黑腹果蠅pArg調節中發揮作用。最新研究表明, pArg是受損原核蛋白誘導蛋白水解的標記物。然而, McsB在真核生物中的作用尚未完全闡明。

　　相比于pHis和pArg, pLys的研究相對較少, 因此它的生物學意義仍然不明確。到目前為止, pLys僅在再生大鼠肝臟中的組蛋白H1上發現。研究人員從活細胞中分離出幾種激酶和磷酸酶, 并且暗示它們對賴氨酸的磷酸化起到調節作用。由于具有相似的化學性質和穩定性, 因此推測pLys可能具有與pHis和pArg類似的作用。

　　綜上所述, 盡管蛋白質N-磷酸化在原核生物中的功能報道較多, 但目前在哺乳動物中的研究仍亟待深入。

　　02富集方法

　　由于生物樣本中蛋白質N-磷酸化的豐度低, 質譜信號易受高豐度組分抑制, 因此對N-磷酸化蛋白質/肽段進行有效富集已成為提高其檢測靈敏度的必要和關鍵步驟。目前, N-磷酸化蛋白質/肽段的富集方法主要包括抗體法、固定化金屬親和色譜法和色譜保留時間差異法等。

　　此外, 還有一些研究者通過生物分子相互作用來實現N-磷酸化蛋白的有效富集。Hofmann等報道了來自Src激酶的SH2結構域可以與pArg肽段結合(Kd=550±150 μmol/L), 并通過進一步突變SH2結構域有望實現pArg肽段的有效富集。Trentini等開發了pArg磷酸酶YwlE的突變體, 保留了對pArg蛋白質的親和力； 將其用來富集枯草芽孢桿菌Δyw1E細胞提取物中的pArg蛋白質, 發現pArg蛋白質在原核細胞的信號傳導方面發揮重要作用。但是, 此方法只能用于pArg蛋白質的特異性富集, 而且YwlE突變體的制備較為繁瑣。

　　03檢測技術

　　蛋白質組學技術的發展為N-磷酸化修飾蛋白質/肽段的規模化鑒定提供了有力的工具。目前, N-磷酸化蛋白質/肽段的檢測主要采用ESI-MS/MS和MALDI-TOF MS。此外, P31NMR也被用于N-磷酸化修飾的檢測。

　　其他檢測方法包括：Wei和Matthews開發了一種基于膜的方法, 用于檢測pHis； 即在常規的激酶測定反應后進行溫和的堿性水解, 在高pH下將產物吸附到Nytran紙上, 在pH 9條件下, 通過液體閃爍計數測定紙上的放射性, 并結合pHis的酸不穩定性使其能夠只針對pHis進行檢測。此外, Sun等開發了一種碘化標記方法:由于咪唑基團上的氫被磷酸基團取代, 因此無法用碘來標記pHis位點, 而可以完全碘化未修飾的His, 從而將兩種組氨酸位點區分開。但由于以上這兩種方法缺乏富集過程, 因此N-磷酸化肽段受到非磷酸化肽段的嚴重干擾。此外, Wagner和Vu通過薄層色譜從[γ-31P]ATP標記的pHis蛋白質的堿水解產物中用放射自顯影檢測到1-和3-pHis。有報道使用鄰苯二甲醛對氨基酸進行衍生化, 并在pH 7.2的聚合物基反相柱(Hamilton PRP-1)上進行HPLC分離, 使用14.3 mmol/L磷酸鈉, 1.1%(v/v)四氫呋喃, 6.6%(v/v)乙腈的等度洗脫條件, 可以完全區分1-pHis、3-pHis和pArg。

　　總結與展望

　　本文綜述了N-磷酸化蛋白質/肽段富集和鑒定方法的研究進展。通過合成穩定的N-磷酸化氨基酸類似物, 可以開發出了一系列針對pHis和pArg的抗體, 并實現相應類型的N-磷酸化蛋白質/肽段的富集。然而, 由于pLys結構更柔軟, 難以產生有效的免疫反應, 因此針對pLys的抗體仍未見報道。此外, 基于IMAC材料和色譜保留時間差異的方法能夠實現pHis和pLys肽段的有效富集。在檢測方法中, 由于MS具有高通量和高準確度的特點, 在N-磷酸化蛋白質/肽段的檢測中顯示出巨大潛力。

　　然而目前蛋白質N-磷酸化修飾的研究才剛剛起步, 仍有很多問題亟須解決。首先, 現有的富集方法難以實現中性條件下N-磷酸化蛋白質/肽段的富集, 因此需要開發更溫和高效的富集方法。第二, 生物樣本中存在相對高豐度的O-磷酸化蛋白質/肽段, 會造成N-磷酸化蛋白質/肽段富集效率低、離子化效率低和位點定位不準確的問題, 因此發展去除O-磷酸化蛋白質/肽段的方法是十分必要的。第三, 在采用正離子模式MS情況下, 常用的酸性流動相會造成N-磷酸化修飾一定程度的水解, 因此亟須發展針對N-磷酸化肽段分離的流動相添加劑, 或是發展高效的負離子模式。最后, 由于N-磷酸基團容易在MS碎裂時發生中性丟失, 因此還需發展適合于N-磷酸化修飾鑒定的MS采集方法。對于新發現的N-磷酸化蛋白質, 其功能尚未揭示, 因此需要推進相關生物學研究。