張貴鋒：從阿膠真偽鑒別到明膠動物溯源分析

　　【導語】第十一期質 譜 沙 龍活動中，中科院過程工程所生化工程國家重點實驗室的張貴鋒博士，給我們做了《HPLC/MS在膠類藥物質量控制中的應用》的報告，各屆反響強烈。今日，分析測試百科網的記者再次走近張博士，詳細了解一下這個項目的來龍去脈，看看他又為我們帶來些什么?

　　阿膠，《神農本草經》滋補上品，稱“久服輕身益氣”。李時珍《本草綱目》：“阿膠，《本經》上品，弘景曰：‘出東阿，故名阿膠’”。自古阿膠與人參、鹿茸并稱“滋補三大寶”，滋陰補血，延年益壽。

　　我國歷代的醫學方書中對阿膠均有記載，可見阿膠在中藥領域的地位，我國歷版藥典對阿膠的原料都做了明確規定-只有使用驢皮制作的膠才是阿膠;但同時藥典里卻沒有明確指出如何檢測阿膠樣品的來源是否是驢皮。因此，市場上出現了用豬皮、牛皮甚至是皮革下腳料代替驢皮制造“假阿膠”。

　　真假阿膠鑒定為什么難?如何解決?

　　筆者的第一個問題就是：

　　為什么阿膠的造假泛濫?難道沒有檢測方法來檢測哪些膠是驢皮做的，哪些膠是豬或牛皮做的?

　　張博士：阿膠中約80%的成分是蛋白質和多肽類物質，而這些蛋白質和多肽類物質中約85%的蛋白屬于膠原蛋白降解物，性質與明膠相似，這是阿膠的主體成分。因此鑒別真假阿膠的本質是要對明膠進行動物種類溯源分析。目前，明膠動物溯源分析的方法主要有四種：鈣鹽促進明膠沉淀方法、氨基酸主成份分析法、酸部分水解法、酶聯免疫反應法，但這些方法的準確度和可行性都存在問題。明膠的動物溯源分析的難點在于：

　　1、 不同動物(如驢、牛、豬等)的同類型蛋白來源的序列差異不大，保守序列的含量特別高。

　　2、 膠原蛋白降解后形成的明膠類多肽物質是一個極其復雜的混合物，其復雜性體現在以下方面：分子量范圍分布特別寬，從幾百到十幾萬均有分布;原料皮質、加工工藝對于明膠分子量范圍影響顯著;明膠中不同多肽的親疏水性相似、等電點相近;要想把這些完全分離開來難度極高，即使是利用二維液相色譜、二維電泳或毛細管電泳也不可能有效地完全分離這種混合物中的不同多肽。

　　3、 膠原蛋白序列本身不穩定，一是在動物生長、發育過程中不同類型的膠原蛋白比例會逐漸發生變化，導致明膠的氨基酸組成不穩定;再有就是同樣的一種膠原蛋白，在動物的生長過程中會發生一系列的翻譯后修飾，最常見的就是脯氨酸發生羥基化修飾后變成羥脯氨酸，賴氨酸發生羥基化修飾后變成羥賴氨酸。以上這兩點導致即使利用同一種動物制備的明膠其氨基酸組分也不是十分穩定。

　　4、 明膠的制備過程對多肽的氨基酸序列有影響：利用動物皮或骨制備明膠的過程涉及高溫蒸煮或酸、堿處理等，在該過程中膠原蛋白的降解規律目前還不十分明晰，但可以確定的是熱降解法或酸堿處理過程導致的明膠中的多肽序列并不完全一致;再有明膠制備過程對膠原蛋白中的氨基酸組成也有影響，常見的如熱降解或酸法處理過程導致谷氨酰胺或天冬酰胺發生脫酰胺現象，對明膠的氨基酸組成以及其中多肽的序列產生影響。

　　所以，以前明知阿膠作假，但由于上述復雜性和難點，很難建立有效的動物溯源分析方法，尤其是，許多偽劣阿膠屬于阿膠(驢皮膠)和其它動物膠的混合物，分析難度更大。

　　不同產地阿膠的分子量范圍

　　分析測試百科網記者：那您是如何建立可靠的檢驗方法的呢?

　　張博士：我從以下三個方面給你介紹一下我們建立的明膠動物溯源方法：

　　1. 理論依據：不同動物的同類型膠原蛋白序列雖然保守序列的所占的比例特別高，但是畢竟不完全一樣的。一個膠原蛋白有三條鏈，如I型膠原蛋白含有兩個α1鏈和一個α2鏈，不同動物的α2鏈之間有40-60個氨基酸是有差異的。正是由于存在這種序列差異為我們建立動物溯源分析的方法提供了依據。

　　2. 實現方法：將不同的膠原蛋白進行序列比對，比對完后將存在序列差異的小肽作為特征多肽(Peptide marker)，通過檢測樣品中不同動物膠原的特征多肽即可解決明膠的動物溯源問題。如何識別有特異性的特征多肽，這就涉及到樣品的預處理、特征多肽的釋放、特征多肽的檢測這三個方面。我們對于這三個方面的每一個環節都做了長時間的摸索，在特征多肽篩選方面我們建立了一個數據庫;在樣品預處理方面，我研究了各種方法對檢測結果的影響;同時，我們還研究了特征多肽含量與明膠分子量范圍之間的關系，以及降解方式對明膠中的特征多肽相對豐度的影響，對于分子量在幾千的明膠來講，這種檢測是沒有問題的。目前常用明膠的分子量范圍遠高于五千。

　　3. 數據解析：做完之后整個數據解析的過程也摸索出一個方法，主要是對特征多肽的檢測。當時做數據解析時，一次質譜分析得到的數據要花十幾個小時進行解析，我記得有一個月每天都早出晚歸，天天埋頭在這些數據里，無法理出頭緒。可經過了這一個月后，我終于找到了一些竅門，了解了一些規律，以后分析起來就得心應手了，現在處理一個樣品的數據只需用幾分鐘的時間。

 

　　應用前景

　　分析測試百科網記者：那么有關阿膠的鑒別方法，您了解的還有哪幾種?

　　張博士：目前還有上海阿華生物工程研究所(隸屬山東東阿阿膠股份有限公司)建立的一種利用PCR儀鑒定方法。阿膠的制作過程比較長，從原料處理到阿膠成品出來大概需要五六天的時間，但實際上最核心的過程也就幾十多個小時。在這幾十個小時里，溫度特別高。如第一次化皮過程溫度較高，時間最長，第二次化皮溫度不變，時間相對短一些，之后得到的原料膠去濃縮溫度也相對較高。雖然理論上濃縮溫度保持在沸點，但是它的內部溫度比表面的溫度要高很多。這樣導致驢皮釋放出的DNA降解嚴重。利用PCR，如果DNA片段的長度低于100bp的話就很難檢測出有效的序列，如何有效從阿膠中提取一定長度的有效DNA片段是這種方法成功與否關鍵。

　　記者：明膠動物溯源的方法還有什么應用前景?

　　張博士：我們將繼續深入研究，爭取將該方法作為對鹿角膠和龜甲膠的檢測列入國家藥典，很多中藥里都含有膠原蛋白降解物，如阿膠、龜甲膠、鹿角膠等，目前市場上也存在很多假膠。所以我們建立的明膠溯源方法在膠類中藥的質量控制方面具有很大的實用價值。這種方法在其它方面還有很多應用，比如：

　　1、明膠可以作為很多藥物的輔料或包裝材料使用，譬如明膠空心膠囊，就是我們吃的藥物膠囊外殼，里面超過90%的成份是明膠。如果按醫藥級要求制作的明膠生產的膠囊售價每1000粒約30元錢左右。目前市場上有些不法分子為了降低成本，就采用廢舊皮鞋皮夾克水解做成明膠，繼而用來做空心膠囊殼，這種方法制備的膠囊價格每1000粒約5塊錢。這不僅僅是涉及到動物來源的問題，更是涉及到一種產品深層次的質量控制問題;

　　2、明膠還可以用作代血漿，即血漿代用品。不同動物來源的原料明膠對代血漿的臨床使用效果影響較大，從這方面講，我們建立的明膠溯源方法有利于明膠血漿代的質量控制;

　　3、一些醫用材料，如手術縫合線，明膠止血海面等這些對動物來源也是有嚴格要求的;

　　4、在食品領域，出口到穆斯林國家里面的食品是不能含有豬來源的膠原蛋白降解物，目前還沒有一個非常好的檢測方法;

　　5、由于瘋牛病和口蹄疫的發生，早在2000年我國就制定了相應的政策，禁止從一些發病國家進口相應的動物來源明膠，包括化妝品和食品等，但無法有效區分動物來源，我們建立的明膠溯源方法在這方面也具有非常大的實用價值。

　　所以，明膠的動物溯源方法以及動物藥真偽鑒別的方法在許多方面具有實用價值。

　　

明膠的動物溯源方法應用領域

 

　　繼續改進方法，達到30分鐘內快速檢測

　　分析測試百科網記者：您這個方法可靠性很強，那么現在是不是就可以推廣普及應用了?

　　張博士：目前，該方法檢測雖然準確性比較高，但是由于檢測時間長(大概十個小時)，對實驗人員的儀器操作能力要求比較高，同時還要求具備一定的譜圖解析能力，所以該方法在實際應用及方法推廣方面存在一定難度。

　　下一步我們的目標是建立一種快速檢測的方法，預想將每個樣品檢測的時間縮短到30分鐘以內。現在該方法主要耗時的步驟是前處理，比如僅酶解一步就需要至少四個小時。所以下一步，我們計劃將樣品的前處理過程壓縮在10分鐘以內，樣品的檢測過程縮短在10分鐘以內，數據解析過程10分鐘以內。其中最關鍵的是改進樣品的前處理過程。

 

　　分析測試百科網記者：就您之前所說，樣品前處理僅酶解一項就需要近四個小時，那您是如何做到將前處理壓縮到十分鐘之內完成的呢?

　　張博士：我們生化工程國家重點實驗室在生物大分子分離、層析介質研發與應用方法方面有多年的研究基礎和經驗積累，也具有不同類型的層析柱和相應的層析介質。目前，我們正在研發一種特殊填料的小層析柱來進行樣品的前處理，屆時，將能把整個前處理過程壓縮到10分鐘以內，明膠動物溯源的快速檢測就變成可以應用推廣方法了。

　　同時，我們還希望把這種生物樣品前處理的方法涉及的層析柱做成耗材產品，我想對那些利用質譜來分析生物大分子的科研人員和常規蛋白分析人員來說，將會為解決他們現有的生物大分子質譜分析前的樣品處理方法的問題有很大的幫助。

 

　　科研體會及原始創新的新思路

　　分析測試百科網記者：您建立這個檢測方法用了多長時間? 您在項目投入中有什么心得呢?

　　張博士：從東阿阿膠股份有限公司委托我們從事阿膠研究到現在已經七年了，項目包括三個方面的研究內容：阿膠成份研究、真偽鑒別和有效部位確認，真偽鑒別只是該項目中的一部分，不是全部時間都用在了真偽鑒別方面，但前期的研究工作的確為我們的方法建立奠定了良好的基礎，同時，這些研究基礎對確定有效部位也十分重要。關于心得體會，一言難盡，我覺得踏踏實實做出點東西后還是一件蠻高興的事，也挺有成就感。當初我們接手這個項目后，我就在思考：既然藥典明確規定阿膠必需使用驢皮制作，阿膠的成份研究應從驢皮開始，因此，我們研究阿膠的成份首先是從不同動物的皮質差異開始做起的，發現阿膠的主要成份是驢膠原蛋白的降解物，在阿膠真偽鑒別方面，我們是從研究膠原蛋白的差異開始的，即在分子層次上根據不同動物膠原蛋白的序列差異，找到了一種通過特征多肽進行明膠動物溯源的分析方法。

　　通過創建這個方法，我個人的體會是：在開發方法時要從一個體系的本質著手，將簡單的事情做得越復雜越好，即考慮的需要盡可能全面，但方法成功轉入應用時，應該越簡單越好，增加方法的實用性。

 

　　記者：現在一些年輕的老師科研經費比較緊張，所以不得不去追求一些熱點的科研項目以便解決經費問題，由于您這里是國家重點實驗室，是不是情況和他們有所不同?

　　張博士：通過這個項目我們能感覺到，對于我們這種專業來說，面向產業中遇到的共性問題，挖掘共性問題中最基本的科學問題，針對這些科學問題確定主攻方向和研究內容，那么這種研究本身就具有潛在的實用價值，如果能有一些進展或小的突破并得到業界的認可的話，就不愁沒有企業感興趣;由于我們在膠原蛋白研究方面的積累，一些企業對我們的研究進展比較關注，目前威海市宇王集團有限公司與我們合作正在進行魚鱗膠原產品開發的一個項目。當然，我感覺追求熱點方向以解決經費問題并不是不好，這與專業、每個人的研究領域和具體情況有關。在生化工程國家重點實驗室，實驗室的蘇主任給了我們每個人很大的自由度，在完成既定的科研任務之外，做什么全由自己決定，同時也給予一部分支持，今天這個方法能開發出來，除了小組中每個人的努力外，與整個平臺的支持和寬松、自由的學術環境是密不可分的。同時我們也非常歡迎大家與我們進行合作，包括蛋白質、多肽、天然產物的分離純化或規模化制備和工藝開發，蛋白質層析介質，藥物劑型(包括蛋白質藥物化學修飾，包埋)，生物反應器研制等。

 

　　記者：動物性溯源分析方法的建立，是不是一個科技含量相當高，一般科研人員做不了的事情呢?

　　張博士：不是的，其實這個方法，對于研究蛋白質組學的人來說都不是一個太大的問題，關鍵就是沒有人愿意去做、去建立該方法。我們當初選題主要基于以下考慮：國際科研水平總體比國內科研水平高很多，如果沿著高端路線走，我們始終是跟在國外科研后面，追不上它的步伐;但保持方法不變，路線改變，不去面向那些高端需求(比如蛋白質組學中研究中的難點問題)，轉而面向一些低端需求(比如這個項目里我們面向的是東阿阿膠這個企業的項目，分析的是常量的蛋白質)，根據低端需求發現一些基礎問題，用我們原來的方法去分析這些低端需求的基本要求后，我們再朝上走，這樣會比沿著高端需求走快的多。

　　不要緊追最時髦的，如果轉向做一些能盡快付諸于應用中的，然后把這些低端需求的應用搞清楚、搞透徹后，一下子就能上一個很高的高度，甚至超過他們。當時，如果我們也去做蛋白質組學，無論是從儀器上、人員上還是環境上，我們都不具有優勢，所以我們另辟途徑，做一些常量蛋白的分析。這就是我們的一個思路，正確與否還有待進一步驗證;總之，對于我個人來說，覺得總是要踏踏實實做點事情才算是過得比較充實。

 

【人物簡介】

       張貴鋒，1998年畢業月天津大學化工學院并進入中國科學院過程工程研究所工作，目前任生化工程國家重點實驗室副研究員，碩士生導師，任過程所聯合分析測試中心副主任；目前主要從事動物和植物源性蛋白質的規模化分離和制備工藝研究、質譜技術在生物大分子分離和分析中的應用和過程分析技術應用研究。

　　【記者觀察】張博士是我國生于七十年代的科研人員的典型代表，他們正站在科研的第一線上辛勤探索，體味失敗的艱辛，品嘗成功的喜悅，探索科學的奧秘。讓我們祝福他們吧，他們必將成為下一個五年、下一個十年我國科技創新的中堅力量。