影響毛細管區帶電泳色譜儀分離的操作條件有緩沖液、添加劑、分離電壓和分離溫度等。
一、緩沖液：
CZE分離過程在緩沖液中進行，緩沖液的選擇直接影響粒子的遷移和分離。
配制緩沖液時，必須使用高純蒸餾水和試劑。使用前要用0.45μm濾膜過濾以除去顆粒等。
1、緩沖液的選擇須遵循的要求：
（1）在所選擇的pH范圍內有很好的緩沖容量。
（2）在檢測波長處無吸收或吸收值低。
（3）為達到有效的進樣和合適的電泳淌度，緩沖液pH值至少與被測組分的等電點相差l個pH單位。
（4）自身淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產生。
（5）只要條件允許，盡可能采用酸性緩沖液。在低pH值下，吸附和電滲流都很小，毛細管涂層的壽命較長。
（6）與毛細管種類匹配，涂層毛細管只能在一定pH范圍內使用。
2、常用緩沖液：
常用緩沖液有硼砂、磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和醋酸鹽等。
3、緩沖液pH值：
（1）緩沖液pH值的選擇與樣品性質有關。
1）通常酸性組分選擇在堿性條件下分離。
2）通常堿性組分選擇在酸性條件下分離。
3）蛋白質、多肽和氨基酸等兩性物質可選酸性（pH = 2）或堿性（pH＞9）分離介質。
4）糖類樣品通常在pH = 9～11能獲得zui優分離。
5）羧酸或其它樣品多在pH = 5～9選擇分離條件。
（2）緩沖液pH值的選擇和毛細管種類有關。
很多涂層毛細管只能在一定pH范圍內使用，如聚丙烯酰胺涂層毛細管只能在pH = 4～9使用，否則涂層易水解失效。
（3）在相同pH下，不同緩沖液的分離效果可能相差很大。
一般來說，能與樣品發生相互作用的試劑可能是zui好的。如分離糖類和DNA等分子時應優先使用硼酸鹽緩沖液，因為硼酸根能與糖羥基形成配位鍵，增加糖的負電荷和分離度。硼酸鹽緩沖液也適用于分離其它含鄰羥基和多羥基的化合物。
（4）為了選擇合適的pH值，需要用pH調節劑調整介質的酸堿性。
由于多數緩沖試劑是酸性物質如磷酸，所以pH調節劑主要是堿類。常用pH調節劑有NaOH、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有機堿如乙醇胺和乙二胺。如果緩沖試劑為堿類，可用酸作為調節劑，盡量使用弱酸如H3PO4。
緩沖試劑和調節劑的濃度對改善分離、抑制吸附和控制焦耳熱等都有影響。一般緩沖試劑的濃度在10～200mmol/L，有時為了抑制蛋白質等的吸附作用，濃度可高達500mmol/L（此時應減少分離電壓）。電導率大的緩沖試劑如磷酸鹽和硼酸鹽等的濃度一般在20mmol/L，電導率小的緩沖試劑如硼酸的濃度可在100mmol/L以上。
二、添加劑：
如果緩沖液經各種參數優化后仍無法給出良好的分離結果，可加入添加劑以改善分離。常用添加劑有：
1、無機電解質：NaCl和KCl等。
2、有機溶劑：甲醇和乙腈等。
3、非電解質高分子：纖維素、多糖、聚乙烯醇和Triton X－100等。
4.、功能性添加劑：手性冠醚和環糊精等。
三、分離電壓：
分離效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是zui優工作電壓。
當毛細管很細或緩沖液電導很低時，極大電壓可能會超出儀器范圍。此時沒有最優電壓，可選擇儀器允許的最大輸出電壓。
當毛細管較粗或緩沖液電導較高時，極大電壓可能很小，若此時分離度很高，可選擇大于極大值的電壓進行分離。
四、分離溫度：
毛細管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率。溫度選擇應考慮熱效應、分析重現性、分離效率和分離介質對溫度的限制等因素。
溫度應通過實驗確定。多數情況下，在20～30℃進行電泳能獲得良好的分離效果。一些糖類樣品需要高于室溫的分離條件，一些樣品如蛋白質等可能需要低于室溫的分離條件。