影響瓊脂糖凝膠電泳色譜儀電泳遷移率的因素有DNA分子大小、DNA構象、凝膠濃度、瓊脂糖種類、電泳緩沖液、嵌入染料的存在和使用電壓等。
一、DNA分子大小：
DNA分子大小遷移速度與logN成反比（N為堿基對數目）。分子越大，摩擦力越大，同時大分子通過凝膠孔的效率低于較小的分子，所以大分子的遷移速度慢。
一般來說，分子帶的電荷量越大，直徑越小，形狀越接近球形，遷移速度越快。
二、DNA構象：
等量的空間結構，緊密結構的遷移速度快，超螺旋環狀DNA＞線狀DNA＞單鏈開環DNA。
三、凝膠濃度：
凝膠濃度越大，分子孔徑越小，DNA遷移速度越慢。反之，遷移速度越快。
凝膠濃度也與凝膠的分辨率有關。凝膠濃度越大，分辨率越高，但分離的DNA片段越小。
四、瓊脂糖種類：
包括標準瓊脂糖、低熔點瓊脂糖和正在研制的介于二者之間的瓊脂糖，其分辨率各有不同。
五、電泳緩沖液：
緩沖液pH值距離其等電點越遠，其所帶凈電荷量越大，遷移速度越快，尤其是蛋白質等兩性分子。
緩沖液pH值影響電泳方向。
緩沖液的離子強度過低，電導率降低，DNA不是全然不動就是遷移極慢。離子強度過高，電導率上升，會產生大量熱能，使凝膠發生變化甚至熔化，也會使DNA變性。
六、嵌入染料的存在：
染色劑溴化乙錠插入雙鏈DNA會造成其負電荷減少，剛度和長度增加，因此，線性DNA－染料復合物在凝膠中的遷移速度降低約15%。
七、使用電壓：
低電壓時，線狀DNA片段的遷移速度與所加電壓成正比。
凝膠上所加電壓不應超過5～8V/cm。