微生物鑒定中常用的生化反應

實驗概要

有些細菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再變藍色。

細菌產生的脂肪酶能分解培養基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培養基pH下降，可通過在油脂培養基中加入中性紅做指示劑進行測試。中性紅指示范圍為pH6.8(紅)～8.0(黃)。當細菌分解脂肪產生脂肪酸時，則菌落周圍培養基中出現紅色斑點。

某些細菌分泌蛋白酶分解明膠，產生小分子物質。如果細菌具有分解明膠的能力，則培養基可由原來固體狀態變成液體狀態。

牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。細菌對牛乳的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊中性時呈淡紫色，酸性時呈紅色，堿性時呈藍色，還原時則部分或全部脫色。細菌對牛乳的利用可分三種情況：

1. 酸凝固作用：細菌發酵乳糖后，產生許多酸，使石蕊牛乳變紅，當酸度很高時，可使牛乳凝固，此稱為酸凝固。

2. 凝乳酶凝固作用：某些細菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，這種凝固在中性環境中發生。通常這種細菌還具有水解蛋白質的能力，因而產生氨等堿性物質，使石蕊變藍。

3. 胨化作用：酪蛋白被水解，使牛乳變成清亮透明的液體。胨化作用可以在酸性條件下或堿性條件下進行，一般石蕊色素被還原褪色。

主要試劑

淀粉培養基：牛肉膏蛋白胨培養基加0.2%的可溶性淀粉；

油脂培養基：牛肉膏蛋白胨培養基加花生油10mL、0.6%中性紅水溶液1mL；

明膠液化培養基：蛋白胨5g，明膠100～150g，水1000mL，pH7.2～7.4，115℃滅菌20min。

石蕊牛乳培養基：牛奶粉100g、石蕊0.075g、水1000 mL、pH6.8，121℃滅菌15 min。

實驗材料

大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、黏乳產堿桿菌(Alcaligenes viscolactis)、銅綠假單胞菌(Psudomonas aeruginosa)、普通變形桿菌(Proteus vularis )

實驗步驟

1. 淀粉水解試驗

1) 準備淀粉培養基平板：將熔化后冷卻至50℃左右的淀粉培養基倒入無菌平皿中，待凝固后制成平板。

2) 接種：用記號筆在平板底部劃成兩部分，在每部分分別寫上菌名，用接種環取少量的待測菌，點接在培養基表面的相對應部分的中心，其中一個菌種應是枯草桿菌做對照菌。

3) 培養：將接種后的平皿置于28℃恒溫箱培養24h。

4) 檢測：取出平板，打開平皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕旋轉，使碘液均勻鋪滿整個平板。菌落周圍如出現無色透明圈，則說明淀粉已經被水解，表示該細菌具有分解淀粉的能力。可以用透明圈大小說明測試菌株水解淀粉能力的強弱。

2. 油脂水解試驗

1) 將裝有油脂培養基的三角瓶置于沸水浴中熔化，取出并充分振蕩，使油脂均勻分布，再傾入無菌平皿中，待凝固成平板。

2) 接種：于同一平皿的兩邊接種，其中一種是金黃色葡萄球菌作為對照菌。置于37℃恒溫箱培養24h，取出后觀察平板菌苔顏色，如果出現紅色斑點，即說明脂肪被水解了，此反應為正反應。紅色斑點大小說明測試菌株水解脂肪能力的強弱。

3. 明膠液化試驗

1) 接種：用穿刺接種法接種大腸桿菌或產氣腸桿菌于明膠培養基中。

2) 培養：放20℃恒溫箱中培養48h。若細菌在20℃下不長，則應放在最適溫度下培養。

3) 觀察結果：觀察培養基有無液化情況及液化后的形狀。

因明膠在低于20℃時凝固，高于25℃時自行液化，若是在高于20℃下培養的細菌，觀察時應放在冰浴中觀察，若明膠被細菌液化，即使在低溫下明膠也不會再凝固。

4. 石蕊牛乳試驗

1) 接種：將黏乳產堿桿菌和銅綠假單胞菌接種入石蕊牛乳培養基中。

2) 培養：將接種后的試管于37℃恒溫培養7d，另外保留一支不接種的石蕊牛乳培養基作為對照。

3) 結果觀察：取出培養物，以不接種任何細菌的試管為對照，觀察接種不同細菌生長后的變化情況。