微陣列中期分裂相染色體的比較基因組雜交（CGH）實驗

高分子質量基因組DNAEcoR I 或 Dpn II

SSCcDNA陣列dNTP 混合液dCTP酵母 tRNADNA 聚合酶 I

Qiaquick PCR 純化試劑盒BioPrime 標記試劑盒Micrcon 30 濾器雜交爐Maxiprep DNA 提取試劑盒

一、cDNA陣列CGH

（1）陣列制備

與變性探針雜交前，先用封閉液（蓋上蓋片）在37℃封閉cDNA陣列1h

（2）隨機引物標記基因組DNA

1.腫瘤和正常組織基因組DNA各2μg分別用Dnp II消化1?1.5h。將消化產物進行純化（QiaquickPCR試劑盒）、真空干燥，用25μL水重懸。

2.使用Bioprime標記試劑盒基本按說明書進行隨機引物標記，稍作改動。100℃變性DNA和20斗隨機引物（試劑盒中含有）5min，迅速放于冰上冷卻，并加人2.5μL dNTP、1.25μL dCTP、IμL Cy3/Cy5-dCTP、IμL Klenow片段(試劑盒中含有），37℃孵育90min。

3.混合Cy3和Cy5標記產物，上樣到Micrcon30濾器。2000g離心10min，檢查樣品容器確定標記產物的存在（紫色）。直接加入30μL Cot-1DNA、100μg酵母tRNA、20μg poly(dA-dT)，5000g離心20min。為了重新收集樣品，加入15ml雜交緩沖液，將Micrcon30濾器倒置放入新的收集管，16000g離心1min。

（3）探針變性和雜交

1.在加熱的水浴鍋或PCR儀上100℃變性探針90s，冰上冷卻探針后，在37℃復性0.5?1h。

2.將探針加到微陣列上，蓋上玻璃蓋片并用橡皮泥封片。在65℃用雜交緩沖液濕潤的濕盒中雜交16?20h。

（4）洗脫

1.將cDNA微陣列于2×SSC、0.03%SDS中65℃洗5min，接著用1×SSC、0.2×SSC室溫下各洗脫5min。

2.低速（50g)離心5min使標本片干燥。

二、陣列CGH

（1）陣列制備

1.基因組克隆（BAC、PAC、黏粒等）在相應抗生素存在的條件下生長，并用商業化試劑盒大量提取基因組DNA,—般得到10μg數量級的產物。用酚/氯仿的標準化程序進一步純化DNA。

2.DNA大小和質量在1%瓊脂糖凝膠電泳上評估，用UV光度計定量DNA。

3.靶DNA經超聲波破碎得到1.5?15kb片段，沉淀、重懸至適宜濃度，用毛細管以200?400μm直徑點樣到玻璃載片上。

4.向陣列上加上20μL封閉液，蓋上蓋片，37℃濕盒復性1h。

（2）用缺口平移法標記基因組DNA制備探針

1.腫瘤和正常組織基因組DNA各2μg分別用缺口平移法進行標記，反應混合物如下：

A) Cy3反應物（加水至總體積100μL

(1)腫瘤基因組DNA:2μg。

(2)10×Cy3dNTP:10μL。

(3)DNA聚合酶1μL。

(4)DNaseI。

B) Cy5反應物（加水至總體積100uL):

(1)正常人基因組DNA:2μg。

(2)10×Cy5dNTP：10μL。

(3)DNA聚合酶1μL。

(4)DNaseI。

2.16℃標記反應1.5h后，將標記反應混合物放于冰上。

3.標記產物的大小在1%瓊脂糖凝膠電泳進行評估，進行CGH實驗的理想片段長度在500?2000bp范圍內。如片段過長，在反應混合物中加入適量的DNA聚合酶I和DNaseI，在16℃繼續反應。

4.向標記反應混合物中加入0.1倍體積的0.3mol/LEDTA終止反應。

5.用Sephade×G50離心柱除去標記混合物中未摻入的核苷酸。

6.混合兩種標記探針，加人50μL Cot-1DNA、0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉、2倍體積的冰冷100%乙醇沉淀探針。用70%乙醇洗滌沉淀、晾干，然后用20uL雜交緩沖液重懸探針。

（3）探針變性和雜交

1.75℃變性探針5min，然后在37℃復性0.5?1h以充分封閉重復片段。

2.將探針加到完成預復性的陣列上，蓋上蓋片并橡皮泥封片，在37℃用雜交緩沖液濕潤的濕盒中雜交24h。

（4）洗脫

1.陣列在55℃50%甲酰胺/2×SSC，pH7.0中洗3次，每次10min，然后在含0.1%NP-40,pH8的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液中室溫洗5?10min。

2.去掉多余的液體，加DAPI/抗淬滅劑后蓋上蓋玻片。

1.在建立標準化的術語方面存在爭議。盡管“探針”指的是結合到微陣列上的已知的核酸序列，而“靶”指的是樣本的未知序列。為了保持一致，本章遵循目前所有微陣列CGH出版物采用的慣稱。

2.在自動化和實用的批量提取方法出現之前，許多實驗室采用大量提取試劑盒提取靶DNA制備微陣列CGH。這是一種費時費力的實驗，靶DNA在多次的陣列點樣后用完時，需要反復多次的提取DNA。如果有足夠的純化靶DNA(用大量或小量制備，至少應有幾百個納克模板DNA)，DOP-PCR可用來提供無限的靶DNA。

3.在整個雜交過程中，確保微陣列濕潤是至關重要的。隨時加入雜交緩沖液以確保雜交盒濕潤，以免探針或封閉混合物蒸發。如果微陣列干了，結果將不可信。

4.這里所列的是對在大約（18X16)mm2范圍內達到3500個樣的cDNA微陣列的優化實驗方案。當采用較大點樣區域內的較高密度的微陣列時，DNA量和最后的雜交體積必須按比例提高。

5.為得到高質量的微陣列CGH結果，未標記的基因組DNA片段大小和純度是非常重要的。用于標記的DNA的純度越低，得到的微陣列結果背景越高、雜交信號越弱。這里敘述的是從新鮮組織中提取基因組DNA進行微陣列CGH的最優實驗方案。

6.選擇用限制性內切核酸酶進行消化對提高標記效率非常重要。值得注意的是，降低標記前DNA片段平均長度，將提高標記效率，而過度消化得到的探針片段太小而不能用于與cDNA靶雜交。在我們實驗室中，使用EcoRI消化人類基因組DNA得到非常滿意的穩定結果。

7.在開始建立實驗方法時，進行一系列的雜交和洗脫溫度梯度實驗，以得到最佳雜交強度和特異性。發現37℃雜交和55℃洗脫可非常靈敏地檢測高拷貝獲得和擴增，而洗脫溫度提高到65℃將降低微陣列的信號強度。過低的洗脫溫度可能產生非特異結合（過多的黃色信號）。我們建議預實驗中用來源不同的樣本DNA進行不同的標記，以得到最佳的實驗技術特異性。

8.到目前為止，仍沒有標準化的陣列制備方法。發表的論文中靶DNA濃度為400?10μg/mL時，用人工點樣在多聚賴氨酸處理的玻片上，或Zyg/yL靶DNA點樣在氨丙基三甲氧硅烷處理過的玻片上[12]。請注意隨著機器點樣儀的自動化程序的出現，DNA濃度和玻片處理方法都可能隨之改變。

9.這里提到的方法是假定在（22X20)mm²玻璃蓋片范圍內構建最大量的小格化點樣面積。另外，假定靶DNA在陣列制備的過程中已經變性。否則，在與探針雜交前，微陣列必須在70%甲酰胺/4×SSC中變性2min

10.探針的最終長度依賴于DNA酶I的濃度。用于CGH實驗的探針最佳長度在500?2000bp范圍內。酶的儲存液濃度為1×10-4U/μL,實驗前用DNA酶I稀釋液新鮮配制成終濃度5×10-5U/μL的使用液。然而，隨著要求所獲得的DNA理想片段長度的改變，酶濃度也相應的做出調整。

11.將0.05?0.1倍體積的每種標記混合物進行DNA染色（如溴化乙錠）的凝膠電泳。由于可以有助于陣列CGH的問題解決，所以推薦采用瓊脂糖凝膠電泳評估標記