快速制備酵母DNA法

實驗概要

本實驗制備了酵母轉化質粒，快速從轉化酵母菌中分離了用于Southern分析的基因組DNA。

主要試劑

2％ Triton X－100，1％SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8)，1mmol/L Na₂EDTA，苯酚：氯仿：已戊醇（25：24：1），YPD培養基，TE緩沖液（pH8），RNase A，無水乙醇，4mol/L醋酸銨

主要設備

1.5ml微型離心管，培養皿，離心機，玻珠，振蕩器

實驗步驟

1. 酵母轉化質粒的制備

   1) 在質粒DNA選擇性培養基中，置30℃培養少量培養物過夜。

   2) 將培養物轉入一支1.5ml的微型離心管，離心5秒，收集細胞。

   3) 小心傾去上清液，輕彈離心管，使沉淀重新懸浮于殘余培養液中。

   4) 加入0.2ml的2％ Triton X－100，1％SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8)，1mmol/L Na₂EDTA；加入0.2ml的苯酚：氯仿：已戊醇（25：24：1）；加入0.3g酸洗過的玻珠。

   5) 振蕩2分鐘。

   6) 離心5分鐘。

   7) 用1～5μl含DNA的水相轉化0.2ml的大腸桿菌受體菌，用15μl水相轉化酵母菌。

2. 用于Southern分析的基因組DNA分離

   1) 用YPD培養基，置30℃培養10ml酵母至最大生長量。

   2) 用醫用離心機離心2分鐘，棄上清液，收集細胞，用0.5ml蒸餾水重新懸浮，將細胞轉入1.5ml微型離心管中，離心5秒收集細胞。

   3) 重復第二步。

   4) 重復第二步。

   5) 加0.2ml TE緩沖液（pH8），振蕩3～4分鐘。

   6) 離心5分鐘，將水相移至潔凈試管，加1ml的無水乙醇，上下倒置，混合均勻。

   7) 離心2分鐘，棄上清液，懸浮在0.4ml TE緩沖液和3μl的10mg/ml的RNase A溶液，置37℃保溫5分鐘，加入10μl 4mol/L醋酸銨和1ml的無水乙醇，上下倒置，混勻。

   8) 離心2分鐘，棄上清液，自然干燥后，用50μl的TE緩沖液懸浮，每份樣品用10μl進行Southern印跡分析，每份用量約2～4μg DNA。

方法評論