總RNA提取實驗——CsCl法

RNA

PBS異硫氰酸胍CsClDEPC無水乙醇

注射器電泳儀離心機培養箱

一、 用于單層培養細胞

1.  室溫下用PBS冼滌細胞，每平皿用5 ml，洗2次。

2.  在不超過10⁸細胞中加入異硫氰酸胍溶液，并使之遍布整個平皿。

3.  用橡皮細胞刮子擦刮平皿，回收粘稠的細胞裂解液。

4.  用裝有20-G針頭的皮下注射器往返抽吸裂解物，并合并在一起。

二、用于懸浮培養細胞

1.  用JS-4，2轉子離心回收≤10⁸細胞，重懸于相當于1/2原有體積的PBS，并再次離心回收細胞。

2.  往離心管中加入3.5 ml 異硫氰酸胍溶液。

3.  用裝有20-G針頭的6注射器將粘稠的細胞裂解液注返抽吸4次，并將其移至一個干凈的試管中。

4.  在經硅化并高壓過的13 mmx51 mm 的異質同晶聚合物超離心管中，加入1. 5 ml 5.7mol/l CsCl。

5.  并在此墊層上加入3.5 ml 細胞裂解液，界面應清晰。

6.  于18℃用Beckman SW-55轉子150 000 g 離心12~20 h（緩慢加速和減速）。

7.  用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子隨液面的下降而下降。

8.  當吸至僅剩約100 ul 時，小心倒置管子，倒出剩余液體。

9.  晾干沉淀約5~10 min，然后以360 ul TES溶液重溶沉淀，反復地以吸管上下抽吸。

10.  如此在室溫進行5~10 min，轉移溶液于另一干凈的微量離心管。 

11.  加入40 ul 3mol/l pH5.2的乙酸鈉緩沖液和1 ml 無水乙醇。

12.  在干冰/乙醇中沉淀30分鐘，離心10~15 min，用360 ul 水重溶沉淀并重復沉淀過程。

13.  讓沉淀晾干10 min，溶解于200 ul 水，取10 μl 稀釋至1 ml 測A₂₆₀和A₂₈₀。

14.  以水溶液或乙醇沉淀的形式在-70℃貯存RNA。

1.  1~5步的操作均在室溫進行。