手把手教程：實驗室檢測艾滋病這樣做

中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心繼發布《全國艾滋病檢測技術規范（2009 年版）》后，近日即將發布 2015 年版《全國艾滋病檢測技術規范》，此規范堪稱艾滋病檢測實驗室的「紅寶書」，適用于疾病控制中心艾滋病確認實驗室和醫療機構的艾滋病初篩實驗室的 HIV 檢測技術操作。

今天來一起了解一下 HIV 是如何在實驗室內被檢測并被確診的。

檢測項目的樣品種類

1. HIV 抗體檢測：全血、血清、血漿、口腔黏膜滲出液、尿液以及干血斑樣品。

2. HIV 抗原檢測：全血、血清、血漿、病毒培養上清液。

3. T 淋巴細胞亞群測定：EDTA 或肝素抗凝全血。

4. HIV-1 病毒載量、基因型、耐藥檢測：血漿、濾紙干血斑（DBS）。

5. HIV 核酸定性與定量、基因型檢測和 HIV-1 分離培養：淋巴細胞富集液、外周血單核淋巴細胞（PBMC）及全血。

當然，實驗室最常用的仍然是血液標本，其他只作為補充樣本。

HIV 抗體檢測

HIV 抗體檢測是艾滋病實驗室檢測的優先選擇項目，在國內絕大多數初篩實驗室應用最廣泛。

1. 初篩方法

（1）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA 法檢測 HIV 抗體是 HIV 初篩實驗室最常用最普遍的方法，目前檢測試劑已經發展到第四代，即同時檢測血液中 HIV-1P24 抗原和 HIV-1/2 抗體，秉承「寧可錯殺一千，不可漏網一個」的革命精神，其靈敏度遠高于特異性，直叫 HIV 抗體無處遁形。

（2）化學發光或免疫熒光試驗（CIA/IFA）

這個試驗方法是近 10 年迅猛發展的一種新型檢測方法，其采用發光或熒光底物，既可檢測抗體，也可聯合檢測抗原抗體，用發光或熒光儀測定結果，其靈敏度較 ELISA 有了進一步的提高，同時帶來的是檢測成本的增加和假陽性率的增高。

（3）快速檢測（RT）方法

此類方法操作簡便快速，適用于應急檢測、門診急診檢測，但靈敏度和特異性遠不如 ELISA 和發光法，但是經濟實惠，也有一定的市場影響力。主要包括以下幾種方法：明膠顆粒凝集試驗（PA）、免疫滲濾試驗、免疫層析試驗。

2. 確認實驗

（1）免疫印跡試驗（WB）

WB 采用間接法檢測樣品中的抗 HIV-1/HIV-2 特異性抗體。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳把分子量大小不等的 HIV-1 蛋白分離開來，經過一系列處理后，硝酸纖維素膜顯示與特異抗原的結合的抗體條帶，從而確診抗體的存在。

（2）條帶 / 線性免疫試驗（RIBA/LIA）

實驗原理基本同 WB 法，不再贅述。

HIV-1 抗原檢測

1.  篩查實驗

（1）酶聯免疫吸附實驗（ELISA 法）：即第四代抗原抗體聯合檢測試劑盒。抗體包被固相反應孔（管）的底部，待測樣本中 P24 抗原與包被抗體形成抗原抗體復合物，再加入酶（HRP）標記的 HIV-1 抗體與抗原結合，加底物顯色，在酶標儀上讀取結果。因同時檢測抗原抗體，靈敏度大大提高，有效縮短了 HIV 感染的檢測窗口期，但因試劑成本較高，在普通篩查實驗室推廣有一定難度。

（2）酶聯熒光分析法（ELFA）：待測樣品的 p24 抗原與包被在固相孔（管）內的 p24 抗體結合，并被生物素標記的 p24 抗體識別。臨床實驗室應用前景不明朗，需要熒光檢測設備，成本較高。

（3）電化學發光法（ECLIA）：待測樣品的 p24 抗原與包被抗體的磁性微粒和發光劑標記的抗體在反應管中溫育，形成磁性微珠包被抗體 - 抗原 - 發光劑標記抗體復合物。

（4）抗原抗體快速檢測法：同快速方法（RT）檢測抗體，不同之處是用 HIV 抗體包被載體，檢測靈敏度同樣較差。

2. 中和試驗

中和試驗主要是 p24 抗原檢測的補充試驗，還可做 HIV-1RNA 的定性或定量檢測，以排除篩查試驗的假陽性。

（1）酶聯免疫吸附實驗（ELISA 法）：待檢樣品先與中和劑（p24 抗原的抗體）共同孵育，如果樣品中存在 p24 抗原，中和抗體將與之結合形成復合物，而不能與固相載體上的捕獲抗體結合。

（2）酶聯熒光分析法（ELFA）：原理和檢測步驟同上述酶聯免疫吸附實驗（ELISA 法），中和率 ≥ 60 %，認為樣品中的 p24 抗原是真陽性。

（3）電化學發光法 (ECLIA)：原理和檢測步驟同上述酶聯免疫吸附實驗（ELISA 法），中和率大于 50%，認為樣品中的 p24 抗原是真陽性。

HIV 核酸檢測

目前國內 HIV 核酸檢測試劑主要為 Taqman 實時熒光 PCR 檢測試劑，可檢測血漿、血清、組織器官或血液制品的 HIV-1RNA 和 DNA，DBS 可用于檢測 RNA/DNA。全球目前正式用于臨床診斷 HIV-1 急性期感染的核酸檢測試劑比較少，主要是美國 FDA 批準的 Gen-Probe 公司生產的 Aptima HIV-1 RNA 核酸定性檢測試劑和歐盟批準的 Abbott M2000 HIV-1 RNA/DNA 定性檢測試劑。

臨床診斷相關的檢測策略及結果報告

HIV 檢測陽性結果的檢測過程一般經歷兩個階段，初篩和復檢程序。以 HIV 抗體檢測為例，具體流程如下：

試劑 1 進行初篩，結果無反應，報告「HIV 抗體陰性」；結果有反應，不能出具陽性報告，必須進入復檢試驗。對初篩有反應的樣品，用原有試劑雙份或雙孔進行復檢試驗（或者兩種試劑復檢），如均無反應，報告「HIV 抗體陰性」；如均有反應或一個有反應一個無反應，進行補充試驗（抗體確證試驗和 HIV-1 核酸試驗），報告 HIV 感染待確定。

目前大部分臨床實驗室為艾滋病初篩實驗室，開展常規初篩實驗，發現陽性結果初步復檢后送省市 CDC 或當地其他確認實驗室做確認實驗。臨床診斷篩查檢測流程見下圖：

目前國內實驗室多采用「初篩抗體 +WB 法確認」等兩步法進行 HIV 檢測及確診，并嚴格進行人員、儀器、方法學質量控制，建立了遍布全國的臨床醫療機構的初篩實驗室及省市 CDC 的確認實驗室，基本滿足了日益增長的艾滋病病人的檢測及病情的變化的監測。