技術推廣DIA+PRM技術，全蛋白篩選及目標蛋白驗證一體化

　　隨著質譜儀器的不斷更新換代，蛋白組學的技術也不斷的革新，從最早的2-D電泳技術到基于LC-MSMS的蛋白定性；從Labelfree 技術到標記定量iTRAQ/TMT技術以及時下備受推崇的DIA/SWATH技術、PRM/MRM技術，每一次的技術革新都使得蛋白組學研究更上一階。

　　當下蛋白組學研究中應用最廣泛的技術是同位素標記定量（iTRAQ/TMT技術）。 iTRAQ/TMT技術利用的用DDA掃描模式，其掃描的方式是將一級質譜信號最強的Top 20的多肽進行二級打碎，然后進入二級質譜進行檢測。其優勢是二級譜圖采集的肽段信息都來源于同一條多肽，有利于后續的定性分析，但這種采集方式會忽略一些肽段的信息；而且對于大樣本量的組學實驗，iTRAQ/TMT技術也存在一定的通量限制。那么有沒有一種技術可以解決目前蛋白組學困局呢？

　　對于組學數據的驗證，常規的方法有：PCR、RT-PCR、WB技術、Elisa技術等，但是對于蛋白組學的驗證，RNA水平的驗證顯然不能滿足科研工作者的要求；WB技術和Elisa技術雖然在某種程度上解決了不同組學之間的尷尬，但是由于抗體的定制難度，在非模式物種中的應用一直無法進行。在這樣的一個基礎上，DIA、PRM技術隆重登場... DIA+PRM技術可以解決目前蛋白組學中存在的這些問題。

DIA技術原理

　　DIA技術是先利用常規DDA質譜檢測技術分析建立圖譜庫，之后采用DIA方法進行質譜數據采集，從而實現對樣品中蛋白質的定性及定量，不同于傳統的DDA技術，DIA技術將質譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，高速、循環地對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測，因此可以無遺漏地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，數據利用度大大提高，缺失值更少。因此，DIA技術更適合于大樣本量、復雜體系的蛋白檢測。

圖1 | DIA技術流程

DIA優勢

　　DDA模式對肽段離子的選擇具有限制性和隨機性，存在較多的數據信息缺失，而DIA模式的目標則是獲得完整的數據，實現蛋白質的深度覆蓋和精準定量。此外在復雜樣品中，二級信號的定量比一級信號更為靈敏（例如一級質譜信號可能存在相似質荷比離子的干擾）。DDA模式為一級質譜信號定量，而DIA模式為二級質譜信號定量，因此DIA模式的定量準確性和重現性都更好。

　　DDA模式下肽段分子和其二級碎片離子有著對應關系，通過對已知數據庫的搜索匹配，即可得到樣本中的肽段及相關蛋白質信息。而DIA模式下肽段離子與其碎片離子之間的直接關系丟失（DIA光譜中的碎片離子可能是由多個肽段離子），復雜的譜圖仍然給后續的數據分析和統計學檢驗帶來很多挑戰。對此目前已有多個團隊開發出DIA分析的軟件，例如OpenSWATH和Skyline，這些軟件通過建立樣本的參考庫，對色譜峰進行抽提并分析。此外也有研發團隊提出不需要參考庫的數據分析方法DIA-Umpire，通過對肽段離子和碎片離子的匹配合成產生虛擬譜圖進而搜庫分析。因此，DIA技術非常適合一次性獲取數百上千種蛋白質更為全面信息（高覆蓋率，高準確度，高重復性）的研究；而且檢測的數據可永久保存，方便后續做回溯性分析。

表1. DIA和DDA技術對比

PRM技術原理

　　PRM：平行反應監測(Parallel Reaction Monitoring) 是一種基于高分辨、高精度質譜的離子監視技術，能夠對目標蛋白質、目標肽段（如發生翻譯后修飾的肽段）進行選擇性檢測，從而實現對目標蛋白質/肽段進行絕對定量。PRM技術基于Q-Orbitrap為代表的高分辨、高精度質譜平臺（MRM技術基于SCIEX Triple Tof 系列質譜，以SCIEX-5600為代表），首先利用四級桿質量分析器的選擇能力，用Q1選擇目標肽段的母離子，隨后在Collision cell 中對母離子進行碎裂， 最后利用Orbitrap分析器在二級質譜中檢測所選擇的母離子窗口內的所有碎片信息。這樣即可對復雜樣本中的目標蛋白質/肽段進行準確地特異性分析。

圖2 | PRM靶向定量蛋白質組學分析基本流程

PRM優勢

　　PRM作為蛋白質組學靶向質譜檢測方法，無需抗體，其通過Q-Orbitrap系列質譜儀，以四極桿作為質量過濾器，特異性地選擇與預先設定質荷比相同的肽段離子（母離子）通過，可以有效排除干擾離子，有著高度特異性。其基于二級碎片離子定量，定量準確度高。與傳統MRM技術相比，更高分辨、更高質量精度的Orbitrap分析器使得其有著更高的靈敏度，且其對二級離子全掃描，無需預設子離子，方法學建立簡便，結果更為準確。以DDA結果建立的PRM參考庫，使得PRM不僅具有靶向定量分析能力，同時還具備定性能力。在確保數據質量的前提下，為了在一次分析中檢測更多的蛋白質，可用預置PRM（Scheduled PRM, sPRM）的方法，這種方法需要知道每個肽段的保留時間信息，使得每個肽段只在其洗脫時間窗口內執行PRM檢測，大大提高了檢測效率，通量高，可同時檢測幾十種蛋白質。其技術優勢使得PRM技術可區分高度相似蛋白，包括驗證蛋白質翻譯后修飾、突變、蛋白亞型等序列高度相似蛋白。

表2. PRM技術優勢

　　PRM和DIA各自都有這么多優勢，那將這2個前沿的技術合起來使用會是什么樣的效果呢？顯而易見，合起來使用，你不僅可以享受到給各自的優勢，還具備PRM驗證可使用DIA的數據庫資源，也就是說不用重復建庫，一個數據庫就搞定（PS：省了一筆重復建庫費用）；另外，PRM驗證讓您不再憂愁各種途徑找定制化抗體。

　　那么DIA+PRM技術能夠適用哪些研究呢？答案是各領域均適用，尤其是針對臨床醫學樣本，更是強力推薦。

圖3 DIA+PRM技術適用于各個研究領域

　　下面讓我們一起來看一個DIA+PRM的文獻實例（J Proteome Res. 2018 Jan 5；17(1):76-85.）

蛋白質組學DIA+PRM技術研究研究Pro-B淋巴細胞Ebf1雜合性

　　Early B cell factor 1（EBF1）是協調B細胞譜系發育所需的關鍵轉錄因子之一。盡管研究表明Ebf1單倍劑量不足（haploinsufficiency）參與白血病的發展，但尚未表征Ebf1雜合性對pro-B淋巴細胞蛋白質組的全局影響。來自德國弗萊堡馬克斯普朗克免疫生物學和表觀遺傳學研究所Gerhard Mittler團隊，通過DDA（data dependent acquisition）和DIA（data independent acquisition）質譜技術鑒定Ebf1+/+ and Ebf1+/-細胞系間的差異表達蛋白，發現DIA鑒定結果無論是蛋白鑒定數目還是得到的差異蛋白數目，均要優于DDA鑒定結果。

圖4. 比較DDA和DIA方法鑒定到的肽段、蛋白質和差異蛋白數量

　　接著該團隊選擇了5種差異蛋白（EBF1, Pax5, TCF3, BCL2 and TNPO3）進行PRM（Parallel Reaction Monitoring）驗證，驗證結果與DIA結果相吻合。結果表明與EBF1相似，其他B細胞譜系調節因子（例如TCF3和Pax5）的表達也在Ebf1雜合細胞中下調。此外DIA差異表達蛋白的功能性分析顯示，EBF1雜合性導致至少八種參與淋巴細胞生成的轉錄因子的失調，并且導致在pro-B淋巴細胞的存活、發育和分化中起作用的關鍵蛋白的失調。

圖5. 候選蛋白的PRM相對定量驗證結果

　　參考文獻

　　Musa YR et al. Comprehensive Proteomic Investigation of Ebf1 Heterozygosity in Pro-B Lymphocytes Utilizing Data Independent Acquisition. J Proteome Res. 2018 Jan 5；17(1):76-85.