擬南芥轉化

實驗概要

本實驗以擬南芥為試材介紹了轉化及篩選的過程。

主要試劑

1. 滲透培養基:(1L)

1/2xMurashige-Skoog

5%蔗糖

0. 5克MES

用KOH調至pH5. 7

再加:10微升lmg/ml的6-BA母液

200微升Silwet L-77

Top agar

0. 1%瓊脂PNS或水溶液

2. 篩選培養基平板

1xMS salt，或1XPNS

pH5.8

0. 8%瓊脂

卡那霉素30mg/l (Columbia，LanDsberg)，Nossen需50mg/l

3. 次氯酸鈉溶液

活性氯5. 2%原液用無菌水臨時稀釋7%使用

實驗步驟

1. 植物生長

    1) 建議在直徑7厘米的培養杯里種5處，每處種幾棵，萌發一周后，每處只留下一棵最好的苗。

    2) 將萌發的植物培養至莖高約3厘米時，去除其頂生花序。注意要避免傷及腋生花序。去除頂生花序將刺激腋生花序的生長。轉化必須在去除頂生花序4天后進行。

    3) 轉化前，將已授粉花以及果莢去除掉。并使土壤吸足水。

    4) 轉化操作

    5) 制備好已轉化了相應質粒的農桿菌菌液l0ml，在轉化前一天，轉入人瓶培養過夜，第二天取出使用時農桿菌液0.D600當在1.2到1.6之間。室溫5000rpm離心15分鐘。棄上清，將農桿菌沉淀懸浮十相應體積的滲透培養基里，使0.D600在0. 8左右。

    6) 用噴霧器將菌液均勻噴灑在待轉化植株上，移入恒溫室豎直培養。

    7) 培養3到4周后，收種子。放在干燥環境存放2周。

2. 轉化子的篩選

    1) 篩選前一般都要消毒，先用70%乙醇浸泡2分鐘，再用次氯酸鈉溶液處理15分鐘，在上述處理時要不停地懸浮種子，最后用無菌水洗四次。

    2) 處理后的種子用Top aga均勻涂布在固體篩選培養基表面。一塊150mm直徑的平皿最多種1500棵。低溫4度春化2到3天，移入恒溫室培養。根據植物篩選抗性不同，來判斷萌發的幼苗是否是轉化子，一般卡那霉素篩選能夠直觀的通過黃綠苗來判斷，而且一般萌發后2-3天即可判斷出來，而潮霉素抗性的轉化子不能通過黃綠苗來判斷，需要在萌發后5-7天通過幼苗的發育來判斷。