2021年6月15日，Cell Reports在線發表了西班牙薩拉曼卡大學生物系Oscar Lorenzo教授團隊完成的題為“Redox feedback regulation of ANAC089 signaling alters seed germination and stress response”的研究文章。該研究發現NAC轉錄因子家族成員ANAC089是氧化還原穩態和NO水平的主要調節因子，并在擬南芥種子萌發和非生物脅迫期間抑制ABA合成和信號轉導。
研究背景
植物激素脫落酸（ABA）和氣體信號分子一氧化氮（NO）參與調控種子萌發和萌發后幼苗的生長。ABA 通過轉錄因子（TF）的復雜信號級聯反應來精細調控ABA 響應并誘導基因表達的變化。NAC（NAM-ATAF1,2-CUC2）家族蛋白是ABA誘導型TF成員，擬南芥NACs，如ATAF1/2、ANAC019/055、NAC2和NTL8等，在不同發育期間參與ABA依賴的非生物脅迫響應。已知在種子萌發過程中，NO通過N-degron途徑和S-亞硝化修飾機制干擾ABA信號轉導以促進種子萌發。然而，與ABA依賴性靶標相關的NO穩態調節信號成分目前還是未知的。
主要結果
1.GAP1編碼在種子中高水平表達的ANAC089轉錄因子
為進一步解析ABA和NO對種子萌發的調控，通過遺傳篩選以鑒別gap（germination in ABA and cPTIO；cPTIO為NO專一清除劑）突變體，結果除abi5外，還分離出gap1-1和gap1-2兩個突變體。經鑒定分析，它們的致變基因為At5g22290，編碼C末端包含跨膜結構域（TM）的NAC轉錄因子ANAC089。ANAC089在種子成熟期間表達，在干種子中的表達水平最高。而且ABA處理能誘導吸脹種子中ANAC089的表達。
2.gap1-1和gap1-2是功能獲得性突變體
萌發實驗結果顯示，gap1-1和gap1-2對cPTIO添加所導致的內源性NO消耗表現不敏感，但野生型和gap1-3敲除突變體的種子萌發則在cPTIO處理后受抑制。同樣，gap1-1和gap1-2在種子萌發和幼苗建成期間顯示ABA不敏感表型。脅迫處理發現，gap1-1和gap1-2對干旱、鹽和低溫的耐受性增強，以上表明它們為功能獲得性突變體，同時也說明ANAC089參與調控非生物脅迫響應（圖1）。此外，全基因組轉錄圖譜和DNA結合特異性分析表明，ANAC089能夠識別并結合氧化還原穩態和ABA響應相關基因啟動子上的特定順式調控元件，以調節擬南芥種子的萌發。
圖1. 種子萌發和脅迫期間ANAC089的功能鑒定
3.gap1突變體改變種子中NO、ABA、硫醇和二硫化物的水平
已有研究通過NO特異性染料檢測發現，在種子吸脹后的胚乳中，gap1-1和gap1-2的NO豐度較高，本研究結果表明種子胚中也存在高水平NO。與野生型相比，gap1-1和gap1-2在種子吸脹過程中NO的釋放量均顯著增加。另外，兩gap1功能獲得性突變體顯示ABA和cPTIO處理不敏感表型，這是由于它們在種子吸脹后較低的ABA和較高的NO內源性水平。此外，gap1-1和gap1-2成熟種子中低分子量硫醇和二硫化物的含量明顯高于對照。gap1-1中硫醇：二硫化物比率的變化可導致GSNO濃度的改變，GSNO是內源性NO的主要儲存形式，從而增加種子萌發期間的NO水平。
4.氧化還原修飾改變ANAC089的亞細胞定位
之前研究將定位于細胞質或內質網的ANAC089完整編碼序列用于體內研究，同時也對缺乏TM的ANAC089截短形式進行組成性核定位觀察。本研究將ANAC089 N端連接GFP標簽，并構建了35S:GFP-ANAC089過表達株系以檢測在不同NO/氧化還原相關和ABA處理下的ANAC089定位。GFP-ANAC089在對照條件下顯示核外定位已被證實，且在低溫、ABA、NO供體GSNO和二硫化谷胱甘肽（GSSG）處理后也檢測到這種亞細胞定位模式。相反，NO清除劑cPTIO和還原劑處理則使錨定在內質網膜上的GFP-ANAC089以C端TM截短形式釋放進入核定位（圖2）。這些發現意味著通過降低內源性NO水平或增加還原劑所引發的細胞氧化還原狀態的改變，能夠促使ANAC089易位到細胞核并促進ANAC089蛋白的積累，以行使轉錄調控功能。
圖2. NO和氧化還原相關處理影響ANAC089的亞細胞定位和蛋白積累
一圖解文
GAP1所編碼的ANAC089轉錄因子在種子中高水平表達，作為ABA合成和響應抑制因子，對低溫、鹽和干旱等非生物脅迫具有正調控作用。胞內氧化還原狀態的變化誘使胞質ANAC089易位至細胞核，在核內，ANAC089與氧化還原穩態和ABA響應相關基因的啟動子特異性結合，從而反饋調節NO水平和細胞氧化還原狀態，并抑制ABA合成和信號轉導。
圖3.ANAC089在種子萌發和非生物脅迫響應中的調控模型
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