揭秘效應性T細胞和耗竭性T細胞早期命運決定

　　T細胞耗竭(T cell exhaustian)是廣泛存在于慢性感染和癌癥環境中的一種現象。在慢性系統性炎癥疾病中，耗竭性T細胞(Tex cells)是控制抗原的主要參與者之一，其高表達免疫抑制分子諸如PD-1, Tim-3 和Lag-3。治療藥物如Anti-PD-1 blockade Nivolumab (Opdivo，中文名歐狄沃)或Pembrolizumab (Keytruda, 中文名可瑞達) 靶向作用于這些免疫抑制分子，已經被證明在多個癌種中擁有較好的免疫響應。然而，只有少部分病人可以達到長期的功能性治愈或者病情控制，而多數病人在短期免疫響應后，沒有得到長期的腫瘤控制。

　　賓夕法尼亞大學的E. John Wherry組在2016年證實，在抗原無法被完全清除的慢性感染環境中，耗竭性T細胞的效應細胞狀態雖然可以被抗PD-1通路療法激活，但是其T細胞命運卻因為表觀遺傳上的不可逆轉性而無法被更改【1】。這種耗竭性T細胞在表觀遺傳上的穩定性，在早期感染階段就已經被耗竭性T細胞特異的核心轉錄因子Tox所部分鎖定【2-5】（詳見BioArt報道：專家點評| 3篇Nature1篇Nat Immuno揭示調控耗竭CD8+T細胞的關鍵因子）。

　　2016年，埃默里大學的Rafi Ahmed組和陸軍軍醫大學的葉麗林組同時揭示，耗竭性T細胞在慢性感染建立后，具有祖細胞(Progenitor)和終末分化細胞(Terminal)兩個主要亞群。前體細胞亞群高表達趨化受體CXCR5和轉錄因子TCF-1，而終末端耗竭性T細胞則高表達免疫抑制受體Tim-3【6,7】。然而，由于耗竭性T細胞早期的細胞命運已經被部分鎖定，因此TCF-1陽性的耗竭性T細胞祖細胞如何分化而來并不得而知。同時，在慢性感染早期，研究人員也并未發現大量高表達PD-1的終末端耗竭性T細胞，什么細胞起到了主要控制當期感染的抗原響應作用，也亟待詳細闡述。

　　2019年10月9日，E. John Wherry組(共一為UPenn免疫系在讀博士生陳則宇和JHU生物統計系在讀博士生季志成)在Immunity 雜志上發表了文章TCF-1-Centered Transcriptional Network Drives an Effector versus Exhausted CD8 T Cell-Fate Decision，揭示在小鼠模型中慢性感染和腫瘤發生早期，存在著耗竭性T細胞前體(Tex precursors)和類效應性T細胞(Effector-like T cells, Teff-like)的二元分化機制的相關報道。

　　研究者們首先使用了單細胞測序技術，使用模擬分化時間預測(pseudotime prediction)的方案，發現在慢性感染早期，可能存在著兩個細胞分化路徑。其中一條高表達以TCF-1(被Tcf7編碼)及其相關下游基因族，而另一條路徑則高表達Granzymes以及以KLRG1基因族為代表的類效應T細胞基因(圖 1). 此分化路徑與之前【5】報道的通過單細胞測序預測的細胞命運結果類似。

圖1. 模擬時間分化預測揭示“耗竭性T細胞前體”和“類效應T細胞”的二元分化路徑。

　　隨后，研究者們利用流式細胞分析技術，在蛋白組層面上詳細的鑒定在感染早期KLRG1+CD39+/Tim-3+的亞群確實具有較高的細胞因子和殺傷性分子分泌特征，同時也具有更高的活躍細胞周期的標記物Ki67。另一方面，TCF-1+Ly108+PD-1+的耗竭性T細胞前體亞群的細胞分泌狀態和周期狀態相對靜息，確認了在慢性感染早期確實存在類效應細胞的亞群。

　　那么細胞周期較為活躍的類效應細胞亞群為何并沒有在慢性感染后期大量出現呢？研究者們進一步發現，相比于耗竭性T細胞前體，類效應細胞亞群具有更高的Bim:Bcl-2比例和更加不穩定的核結構狀態。進一步的流式分選-譜系追蹤實驗表明，KLRG1+CD39+類效應細胞亞群很難在慢性感染持續過程中存活，而TCF-1+PD-1+的耗竭性T細胞前體可以較好存活并部分分化為TCF-1-PD-1++的終末分化耗竭性T細胞。然而，研究者們并沒有觀察到在抗原維持高位的時間段里，耗竭性T細胞前體可以分化為類效應T細胞的證據，進一步證明了類效應T細胞和耗竭性T細胞在持續的慢性感染中是兩條不同的細胞命運(圖 2).

圖2. 譜系追蹤實驗證明耗竭性T細胞亞群比類效應T細胞亞群有更好的長期生存。

　　這個二元分化機制的分子機理又是什么呢？研究人員將目光再次鎖定到了轉錄因子TCF-1上。在CD8 T 細胞上特異性敲除TCF-1，會導致在早期的KLRG1+CD39+類效應T細胞亞群的增多，但是在長期慢性感染中，因為耗竭性T細胞前體的缺失，總體的抗原特異性T細胞數量會發生銳減。進一步的，研究人員發現，過表達TCF-1會增加耗竭性T細胞前體的比例，從而使得整個抗原特異性T細胞庫在長期維持一個較穩定的水平。研究人員還發現，敲除PD-1后，雖然T細胞總體會發生擴增，但是其中TCF-1+的前體細胞比例會下降，揭示了PD-1可能在感染早期起到了對于抗原特異性T細胞的保護作用，防止其發生過度激活而引發的T細胞死亡。

　　之后，研究人員將目光鎖定到了闡明TCF-1作為核心轉錄因子，如何系統性的控制整個細胞命運決定的機制。因為轉錄因子在單細胞測序中通常存在檢測量偏低的問題，研究人員首先建立了基于轉錄因子在pseudotime analysis上的關聯性來預測基因之間關系的方法(StateTransition Inference Predictor, STIP). 該方案減小了轉錄因子關聯預測因為低檢測造成的假陰性結果，并且與ATAC-Seq進行融合網絡分析后, 重構了Tcf7的可能下游轉錄因子調控網(圖3)。

圖3.TCF-1 下游轉錄因子調控網

　　研究者選定了兩個主要的TCF-1下游轉錄因子進行驗證實驗。首先，研究者們證明了TCF-1是介導Tbox轉錄因子T-bet和Eomes之間轉換的核心因子。TCF-1直接在轉錄上增加了Eomes的表達，而Eomes本身是耗竭性T細胞生存的必要分子。其次，研究者們證明了TCF-1可以提高c-Myb的表達量。與之前的研究相同的是，c-Myb介導了Bcl-2的高表達，從而增強了耗竭性T細胞前體的存活【8】。

　　該項研究首次從分子機制層面上揭示了在慢性感染環境中，效應和耗竭性T細胞的二元分化路徑。同時，該研究系統而精確的解答了TCF-1作為耗竭性T細胞前體細胞/祖細胞中的關鍵轉錄因子，控制T細胞分化與存活的機制。這些發現對于當下的CART治療方案中，是否應該使用更高的促效應T細胞的細胞因子預處理，以及對是否需要在CART設計中引入促細胞活化/生存的因子提供了借鑒。同時，對于判斷免疫檢查點抑制劑阻斷劑造成的效應T細胞效果的持續性，以及是否應該進一步跟進免疫檢查點阻斷劑治療劑量，給予了相應的參考價值。

　　專家點評

　　葉麗林（陸軍軍醫大學全軍免疫學研究所）

　　CD8 T 細胞功能性耗竭是機體免疫系統不能清除慢性病毒感染（HBV, HCV,HIV等）及腫瘤的主要原因。耗竭的CD8 T細胞表達PD-1，TIM3，LAG3， TIGIT等免疫檢查點抑制性受體。以PD-1抗體為代表的免疫檢查點阻斷療法在腫瘤臨床治療領域取得重大成功，其作用機理主要在于阻斷免疫檢查點受體介導的抑制性信號通路，可以在一定程度上逆轉CD8 T細胞耗竭，從而可以部分恢復其抗腫瘤的免疫功能。但是，不是所有的耗竭性CD8 T細胞都可以功能性地響應PD-1治療。我們和 Rafi Ahmed團隊同時發現，耗竭的CD8 T細胞是異質性的，存在耗竭性祖細胞（Progenitor， CXCR5+TCF-1+Tim3-）,及耗竭的終末分化細胞（Terminally differentiated, CXCR5-TCF-1-Tim3+），并且只有precursor細胞可以功能性的響應PD-1免疫檢查點阻斷【6,7】。這些研究進一步地揭示了耗竭的CD8 T細胞響應PD-1免疫檢查點阻斷的分子及細胞機制。但是，這兩群細胞在免疫應答的早期如何形成、如何調控及如何維持并不清楚，是領域內亟需回答的科學問題。

　　最新在線的免疫學頂級期刊Immunity, 來自賓夕法尼亞大學醫學院免疫學系John Wherry研究組的陳則宇等利用小鼠的LCMV-CL13慢性病毒感染模型，采用單細胞測序及分析技術，發現在感染后的第八天，病毒特異性的CD8 T細胞呈現二元分化途徑，即KLRG1+效應性T細胞及PD-1+Ly108+耗竭性前體（Precursors）T細胞，而耗竭性前體T細胞則會進一步分化為終末分化的PD-1+CD39+的耗竭性T細胞。在此二元分化命運的抉擇中，轉錄因子TCF-1起著關鍵作用，其促進耗竭性前體細胞的分化，而抑制效應性T細胞的分化。隨著耗竭程度的加深，KLRG1效應性T細胞幾乎凋亡殆盡，而耗竭性T細胞，包括前體T細胞與終末分化細胞則可維持下來。TCF-1可以維持耗竭性T細胞pool，在于其可上調轉錄因子EOMES及Myb, 特別是后者可以抵抗細胞凋亡；而TCF-1自身的表達則依賴于PD-1介導的抑制性信號通路，因為過強的TCR信號刺激通常會導致TCF-1表達下調。這些研究結果加深了我們對CD8 T細胞耗竭動態過程的理解，強調了TCF-1的表達對于PD-1免疫檢查點治療效應的關鍵作用，并且提示，增強TCF-1的表達可能會提升PD-1免疫檢查點治療的效力。

　　專家點評

　　伍拓琦（科羅拉多大學免疫與微生物系）

　　慢性感染和腫瘤病人中的CD8 T淋巴細胞發生功能耗竭，因而無法有效清除感染細胞或者腫瘤細胞。導致CD8 T細胞耗竭的因素眾多。其中包括了PD-1等受體介導的免疫檢驗點信號，微環境中的免疫抑制性因子，以及持續T細胞受體信號刺激。過去二十年包括免疫檢驗點阻斷（immune checkpointblockade）和過繼性細胞免疫治療(adoptive cell therapy)在內的免疫療法在治療癌癥上取得了突破性的成功。然而并非所有病人都對免疫治療有臨床反應。因而在細胞分化和分子通路層面上理解T細胞對免疫治療的反應對未來進一步提升免疫治療的療效有至關重要的意義。我們以及其他團隊發現耗竭T細胞群包括了祖細胞(progenitor-like)及終末耗竭細胞(terminally exhausted)兩個亞群【6,7,9-11】。其中祖細胞亞群是維持CD8 T細胞介導的長期免疫反應以及對免疫檢驗點阻斷的免疫反應起關鍵作用的細胞群。這個細胞群的分化被TCF-1在內的轉錄因子以及諸如type I interferon等細胞因子調節。我們團隊今年用單細胞RNA測序揭示轉錄因子TOX介導的信號調控祖細胞與記憶前體細胞(memory precursor)在免疫應答早期的分異【5】。然而，耗竭細胞的另外一個亞群終末耗竭細胞的分化調控以及其與效應細胞(effector cells)關系仍不清楚。

　　賓夕法尼亞大學醫學院免疫系John Wherry實驗室的陳則宇等使用單細胞RNA測序比較了病毒特異性CD8 T細胞在LCMV慢性與急性感染第八天的單細胞轉錄組。這篇最新在Immunity上線的文章揭示慢性病毒感染早期病毒特異性細胞除了祖細胞以及終末耗竭細胞之外還包括第三個KLRG1+亞群。此亞群在分化與功能上與急性感染中的終末效應細胞類似并在慢行感染兩周內消失，故名為類效應細胞(effector-like T cells)。類效應細胞分化被轉錄因子TCF-1抑制并在慢性感染早期即與祖細胞分異。陳則宇等開發了新的虛擬時間(pseudotime)算法state transition inferencepredictor (STIP)并揭示了在細胞分化時間軸上不同轉錄因子以及轉錄程序的演變以及相互作用。他們通過STIP發現了TCF-1下游的調控網絡并通過TCF-1敲除及過表達證明TCF-1直接誘導轉錄因子Eomes和Myb表達。這一工作進一步闡明了耗竭T細胞異質性隨時間推移的演變以及調控這一過程的轉錄網絡的構架。其工作對深入理解免疫療法如何促進耗竭T細胞的免疫反應有指示性作用。該工作所揭示的新亞群在組織中的分布、對抗病毒及抗腫瘤免疫反應的作用、以及對機體的病理性影響仍將吸引未來的進一步探索。

　　原文鏈接：

　　https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(19)30409-1

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