CART和CART療法基礎

免疫療法是當下腫瘤治療領域最具前景的發展方向之一。隨著PD-(L)1等免疫檢查點抑制劑應用范圍逐漸擴大，CAR-T療法研究不斷出現新的進展，CAR-T療法作為有別于傳統藥物的“活藥”，不僅對復發、難治性腫瘤患者表現出了突破性療效，其生產體系和使用場景也有別于普通藥物。鑒于當下生物技術的更新速度，預計CAR-T療法還將帶給市場更多驚喜。

CAR-T基礎知識.pptx

什么是CAR-T療法

想要了解CAR-T，我們首先聊一聊普通T細胞是如何在免疫系統發揮作用的。在免疫系統中，T細胞需要借助抗原遞呈細胞(APC)來殺死異常細胞。APC表面有許多用于識別細胞表面抗原的MHC(主要組織相容性復合體)分子，等APC識別到異常細胞之后，MHC就會和T細胞受體(TCR)結合，把信號傳遞給T細胞。在CD3、CD4和CD8等分子的幫助下，T細胞才能最終識別異常細胞并將其殺死。但是腫瘤細胞卻把自己的這些“指紋”給毀了，導致APC細胞就無法識別它。

CAR-T(嵌合抗原受體T細胞)是通過基因改造技術，讓患者T細胞表達嵌合抗原受體，使效應T細胞的靶向性、殺傷性和持久性均較常規應用的免疫細胞高，并能克服腫瘤局部免疫抑制微環境和打破宿主免疫耐受狀態。

CAR-T的前世今生

嵌合抗原受體(CARs)是由一個胞外抗原結合域(通常是一個單鏈抗體，也可以是多肽或者其他蛋白質)，一個鉸鏈區(促進抗原受體與腫瘤抗原的結合)，一個跨膜區(用來固定CAR)，一個T細胞激活結構域(CD3 ζ，提供T細胞活化的第一信號)以及一個或多個胞內共刺激結構域組成(CD28/4-1BB，提供T細胞活化的第二信號)。CAR的胞外部分用來識別特異性的腫瘤抗原，隨后胞內信號域會刺激T細胞增殖，并且通過細胞溶解和細胞因子釋放來消除腫瘤細胞。

歷經十余年，CAR-T經歷了四代結構，每一代結構都是在各個細節上突破，使CAR-T往更為精準、更為高效、更為持久的方向發展。

1989年，第一代基于免疫球蛋白樣scFv和FcεRI受體(γ鏈)或CD3復合物(ζ鏈)胞內結構域融合的Car-T細胞被發展出來。該Car-T細胞雖然具有激活T細胞的能力，但是只含有激活受體CD3-ζ，無法完全激活其活性。大多數試驗在細胞擴增、體內存活時間、細胞因子分泌等方面存在不足，治療效果不明顯。

2010年，在第一代的基礎上，第二代CAR引入一個共刺激受體結構域(包括CD28、4-1BB、DAP10等)，CD28對提高初始T細胞獲得持久的體外增殖和較強的細胞因子分泌非常重要，在臨床試驗中顯著改善了CAR-T免疫活性激活的問題，并提高了其作用持久性。

2012年，以逆轉錄病毒為載體構建了第三代CAR-T細胞，第三代CAR則包含兩個共刺激結構域，一個為CD28或4-1BB，另一個為OX40、CD28或4-1BB。相比于二代CAR，雖然在一些前臨床試驗數據中表現出更強更持久的作用活性，但也有報道指出，三代CAR可能會造成T細胞刺激閾值的降低，引起信號泄露，可能誘發細胞因子過量釋放。

第四代Car-T細胞，在保留了第三代兩個共刺激和激活信號的基礎上，還進一步引入了分泌細胞因子(主要是IL-12)的基因，被稱為TRUCK T細胞(T cell redirected for universal cytokine-mediated killing)。TRUCKs還可以用于病毒感染、代謝病與自身免疫病等領域。目前，四代CAR-T療法已經在包括神經母細胞瘤在內的實體瘤治療的臨床試驗中開展。

然而，對目前來說，第三、四代Car-T細胞發展仍未完善，仍有諸多問題有待解決，第二代Car-T細胞對于血液惡性腫瘤具有很好的療效，是Car-T領域的主流。

CAR-T副作用

CAR-T治療中最主要的副作用就是細胞因子風暴(cytokine release syndrome, CRS)，也是CAR-T技術在臨床應用中一個最主要的不良反應。由于T細胞在體內的大量增殖，導致細胞因子釋放出來，引起患者出現發熱或發燒，肌痛，低血壓，呼吸衰竭等癥狀，這是導致試驗患者死亡的主要原因之一。

還有一個副作用是靶向非腫瘤細胞毒性。由于CAR-T抗原的靶向性非常強，無法區分表達相應抗原的腫瘤細胞和正常細胞，因此CAR-T都會攻擊表達相應抗原的腫瘤細胞和正常細胞。比如，針對CD19的CAR-T細胞治療，導致B細胞發育不良，靶向HER2的CAR-T細胞會導致其他組織或器官遭受攻擊，如心肺系統毒性。

CAR-T細胞療法最新研究進展

DOI:10.1038/s41591-019-0421-7

來自北京大學腫瘤醫院的朱軍教授團隊和南加州大學Si-Yi Chen教授團隊合作在Nature Medicine上發表了最新研究，表明他們的新方法可以消除CAR-T療法的嚴重副作用，使得這種療法更加安全。

左圖為患者的CT圖，右圖為所有患者的治療效果統計

而在這個最新的CAR版本中，研究人員調整了CAR的序列和形狀，使得這些CAR-T細胞可以殺傷癌細胞，但是產生的細胞因子更少，增殖速度更慢，因此血液有足夠的時間清除細胞因子。這個改進版的CAR-T細胞可以在病人體內增殖并分化為記憶細胞，因此會產生強烈而持久的抗癌效應，同時不會引起毒副作用。

DOI: 10.1038/s41586-019-1054-1

文章中指出，腫瘤細胞竟然利用T細胞的胞啃作用，把自身可以被CAR-T細胞識別的抗原轉移到CAR-T細胞上，這樣在逃避CAR-T細胞攻擊的同時，也成功離間了CAR-T細胞，使其自相殘殺，從而導致治療失敗。

該團隊研究發現，只有具有胞啃(trogocytosis)作用的CAR-T細胞，才會接受癌細胞上的靶抗原。胞啃作用是指淋巴細胞通過免疫突觸，從抗原提呈細胞上獲得了一部分表面分子的過程。胞啃作用在免疫應答過程中的作用尚不十分明確，可能對免疫反應的誘導和調節有重要作用，但在CAR-T治療過程中，卻成為癌細胞在免疫逃逸的同時引起CAR-T細胞的自相殘殺的罪魁禍首。

DOI: 10.1093/brain/awz053

為了明確CAR-T相關神經毒性的臨床癥狀，研究團隊對2015年至2018年間收治于達納-法伯/布里格姆和CAR- T細胞治療婦女癌癥中心(Dana-Farber/Brigham and Women's Cancer CenTer for CAR T-cell Therapy)的100名淋巴瘤患者進行了觀察性隊列研究。

他們的發現揭示了CAR-T治療后神經癥狀的普遍流行。最常見的癥狀是腦病，這是一種引起混亂的腦部疾病，但也有其他癥狀，如頭痛、震顫、虛弱和語言障礙。重要的是，這些影響大多是可逆的，而且癥狀幾乎總是隨著時間的推移而消失。此外，研究人員在他們的研究中發現了一種獨特的活動或不活動模式。與治療相關的神經功能障礙往往起源于代謝功能似乎不活躍的區域。這一發現對神經毒性的臨床評估和影像學的應用具有重要意義。

CAR-T名詞解釋

CAR-T療法就是嵌合抗原受體T細胞免疫療法，英文全稱Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy。這是一種治療腫瘤的新型精準靶向療法，近幾年通過優化改良在臨床腫瘤治療上取得很好的效果，是一種非常有前景的，能夠精準、快速、高效，且有可能治愈癌癥的新型腫瘤免疫治療方法。

T細胞也叫T淋巴細胞，是人體白細胞的一種，來源于骨髓造血干細胞，在胸腺中成熟，然后移居到人體血液、淋巴和周圍組織器官，發揮免疫功能。其作用相當于人體內的“戰士”，能夠抵御和消滅“敵人”如感染、腫瘤、外來異物等。

在實驗室，技術人員通過基因工程技術，將T細胞激活，并裝上定位導航裝置CAR（腫瘤嵌合抗原受體），將T細胞這個普通“戰士”改造成“超級戰士”，即CAR-T細胞，他利用其“定位導航裝置”CAR，專門識別體內腫瘤細胞，并通過免疫作用釋放大量的多種效應因子，它們能高效地殺滅腫瘤細胞，從而達到治療惡性腫瘤的目的。

中文名：嵌合抗原受體T細胞免疫療法

外文名：Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy

治療范圍

目前大部分CAR-T療法還處于臨床實驗階段，其中治療范圍集中在以下領域：

1.復發的急性B系淋巴細胞白血病（經過治療緩解后再次發作），或者難治的急性B系淋巴細胞白血病（使用其他抗白血病治療后病情沒有緩解的）。

2.兩種或兩種以上方法治療失敗的大B細胞非霍奇金淋巴瘤。

3.CD19陽性復發、難治惡性淋巴瘤。

4.CD19治療失敗，CD22陽性的急性淋巴細胞白血病。

CAR-T療法在其他抗腫瘤領域也有臨床實驗研究，但效果尚不明確。

治療流程

標準的CAR-T治療流程主要分為以下七個步驟進行：

1.評估病人是否符合CAR-T治療的適應癥

2.分離T細胞：通過外周血血細胞分離機從腫瘤病人血液中分離出單個核細胞，進一步磁珠純化T細胞。

知識：T淋巴細胞(T lymphocyte)簡稱T細胞，是由來源于骨髓的淋巴干細胞，在胸腺中分化、發育成熟后，通過淋巴和血液循環而分布到全身的免疫器官和組織中發揮免疫功能。

3.改造T細胞：用基因工程技術，把一個含有能識別腫瘤細胞且激活T細胞的嵌合抗原受體的病毒載體轉入T細胞，即把T細胞改造成CAR-T細胞。

4.擴增CAR-T細胞：在體外培養以大量擴增CAR-T細胞。一般一個病人需要幾千萬，乃至幾億個CAR-T細胞，體重越大，需要細胞越多。

5.CAR-T細胞回輸入人體：把擴增好的CAR-T細胞通過靜脈回輸到病人體內，開始進行腫瘤細胞免疫治療。

6.監控反應：嚴密監護病人身體反應，尤其是細胞輸入體內后一至兩周內可能發生劇烈不良反應。

7.評估治療效果：多在回輸CAR-T細胞后第15天和第30天評估對原發病的治療效果。

整個療程持續5周左右，其中上述第一步到第三步需要2周，花費時間較長。

不良反應

CAR-T療法無疑為癌癥治療帶來新希望，然而，這種療法也有嚴重不良反應，主要是細胞因子釋放綜合征（也叫細胞因子釋放風暴，CRS）和神經毒性。如果處理不及時可能會危及生命。所以輸注CAR-T細胞后必須嚴密監測。

細胞因子釋放綜合征（CRS）發生原因是由于大量CAR-T細胞輸入體內，導致免疫系統被激活，釋放大量炎性細胞因子，從而使人體產生嚴重不良反應。該綜合征的臨床表現包括：高燒，發冷，惡心，疲勞，肌肉疼痛，毛細血管滲漏，全身水腫，潮紅，低血壓，少尿，心動過速，心功能不全，呼吸困難，呼吸衰竭，肝功能衰竭，腎功能損害等。

神經毒性發生原因目前不是很清楚，可能與CRS有關。臨床表現包括頭痛，譫妄，語言的部分能力喪失，反應遲鈍，癲癇發作，昏迷等，甚至因腦水腫引起死亡。

過敏反應也是可以預見的不良反應，包括等。主要是皮疹，其他反應無法跟CRS區分，對于呼吸困難，水腫，血壓下降等癥狀臨床會歸于CRS反應。

如何應對不良反應

無論國內還是國外，CAR-T療法安全問題一直是大家關注的焦點。目前來看，CAR-T療法發生不良反應是不可避免的，CAR-T療法還沒有完全精準到只針對腫瘤細胞，而對正常人體細胞不起效應。

CAR-T細胞回輸病人體內后需要病情監測15天到4周。頭15天需要住院嚴密監測不良反應。出院后4周內不能離醫院太遠，以方便到醫院及時處理不良反應。

通過這幾年的努力，目前治療機構已經形成了一套對付CAR-T療法的不良反應的方案，包括治療細胞因子釋放綜合征的有效藥物：降低血液中IL-6水平的抗IL-6受體抗體-托珠單抗，同時激素的使用可以很好地控制其不良反應（NCCN2018年immunotherapy治療指南）

通過提高臨床預見性，識別不良反應的高危因素，可以降低不良反應發生的概率。例如：通過在CAR-T細胞回輸病人體內前在預化療中加入降低腫瘤負荷的化療方案，以降低病人體內腫瘤負荷，達到減輕治療不良反應。

CAR-T細胞治療過程中全血細胞減少非常常見，對于本身存在感染的患者，治療過程中，極有可能加重感染，若病人感染未得到控制，暫時不宜回輸CAR-T細胞，應該待感染有效控制后再用。同時對于治療過程中出現全血細胞減少的病人，必要的抗生素治療可以有效阻止感染的發生。對于CAR-T治療后長期隨訪的病人，B細胞及免疫球蛋白數量的減少也非常常見，建議每月一次的免疫球蛋白檢測及丙球的輸注，可以有效避免因低球蛋白血癥導致的兇險感染。

影響CAR-T療法的因素

1.病人的自身情況：CAR-T療法的首要條件是能夠從病人身上收集足夠的高質量的T細胞。某些病人，由于前期化療，或者疾病很嚴重，體內T細胞數量和質量都無法滿足CAR-T療法所需要的T細胞。另外，腦內腫瘤負荷大的病人，考慮到致命的不良反應，也是不能馬上用CAR-T療法。

2.CAR-T的制造工藝和過程：CAR-T療法過程很復雜和高端。涉及T細胞的篩選收集、基因改造、活化、培養、擴增、修飾等，每一步都需要精心的設計和質量控制，哪一步出現差錯都會影響CAR-T療法。比如，有案例顯示，T細胞中混入了B細胞雜質，導致病人對CAR-T療法產生抗性。這說明細胞的純度非常重要。

3.腫瘤自身的特性：有研究顯示，接受抗CD19和抗CD22的CAR-T細胞療法后一年內有近一半的病人腫瘤復發。這和腫瘤逃逸和CART持續性有很大關系。如何找到更多的腫瘤靶點并盡可能殺盡腫瘤，如何增加CART在體內的持續性還是有待改進和開發。

4.治療的不良反應：一般來說，有細胞因子釋放風暴的不良反應，表明機體對治療有反應，殺滅腫瘤有效果。但是嚴重不良反應往往需要提前采取措施中斷CAR-T細胞在體內的殺滅作用。這是否會影響消滅腫瘤的最終效果，還有待進一步評估。

體內腫瘤負荷：最近紀念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（MSKCC）的研究顯示，CAR-T細胞治療前體內腫瘤負荷較輕（異常增生的原始細胞<5%）的患者，他們的治療效果更好，長期緩解率更高。

另外，上述實驗也顯示，CAR-T細胞治療后完全緩解率與病人是否進行過骨髓移植、化療種類、患者年齡、做過幾種治療以及CAR-T的劑量等因素基本上都沒有關系。