新進展！蛋白核心巖藻糖基化與OGlcNAc位點解析

　　蛋白糖基化是蛋白翻譯后修飾之中最為復雜的一類修飾，在藥物研發和新的藥物靶點發現中頗具應用前景。然而，與生物系統中蛋白質糖基化的多樣性相比，聚糖分析的工具仍然有限，直接限制了蛋白糖基化在藥物研發中的應用。中國科學院上海藥物研究所文留青課題組前期發展了基于生物素探針分子和糖苷內切酶的可逆標記策略，實現了對核心巖藻糖的可逆標記研究，在組學水平上解析了蛋白核心巖藻糖糖基化在細胞表面的分布。然而，該團隊在利用先前報道的方法對更復雜的生物學樣本進行分析時發現，由惡唑環化的生物素探針分子引起的非特異標記反應。

　　上海藥物所文留青課題組與周虎課題組發展了基于溫敏材料（PNIPAM）探針分子的新一代標記方法。實現了在多肽水平上對細胞內兩種重要的蛋白糖基化（核心巖藻糖基化和O-GlcNAc糖基化）的同步精準解析（又名“一石二鳥策略”）。相關以Two Birds One Stone” Strategy for the Site-Specific Analysis of Core Fucosylation and O-GlcNAcylation為題，作為當期封面，在線發表在《美國化學會志》（JACS）上。

　　該團隊探討了不同細菌來源的突變型糖苷內切酶（N糖合成酶活性）和野生型糖苷內切酶（N糖水解酶活性）對于O-GlcNAc與核心巖藻糖的選擇性。研究發現，EndoCC-N180H能夠特異性地識別O-GlcNAc糖肽，催化活性優于已報道的EndoM-N175Q。而EndoF3-D165A能夠選擇性地標記核心巖藻糖肽（之前報道發現）。兩種酶同時都能高效地利用非天然的疊氮化底物分子（探針1），從而對核心巖藻糖肽和O-GlcNAc糖肽進行分別標記。在進行“one-pot”的標記反應之后，研究利用二苯并環辛炔（DBCO）功能化的溫敏材料（探針2），通過無銅催化反應對標記的糖肽分子進行捕獲富集。富集后的肽段仍可被野生型的糖苷內切酶EndoCC與EndoF3識別并切割釋放，從而實現“可逆無痕”標記。釋放的糖肽，通過質譜分析得到蛋白糖基化位點信息。該方法避開了使用傳統生物素探針（非特異性標記信號和探針分子除去困難）和常見固相合成材料（難以被糖苷內切酶識別）。在常溫下，PNIPAM能夠溶解在水中；升溫時，PNIPAM析出，通過簡單離心即可實現糖肽的富集，操作便捷。PNIPAM的溫敏特性契合了酶催化的反應溫度，并能通過簡單的升溫和降溫操作實現富集操作。

　　科研人員利用新建立的富集策略，研究三種腫瘤細胞系的糖蛋白組學，獲得了比多數報道方法更多的蛋白糖基化位點數。組學結果顯示，核心巖藻糖基化主要與細胞表面和細胞外基質的功能相關，而O-GlcNAc糖基化主要與細胞核和DNA轉錄過程相關。保守的糖基化位點分析發現，核心巖藻糖蛋白主要與PI3K-Akt信號通路相關，而O-GlcNAc糖蛋白主要與Notch通路相關。這與此前報道的研究結果吻合，進一步佐證了該方法的可靠性。該方法是在多肽水平對目標樣本進行標記和富集，因而具有更廣闊的應用場景，例如，可實現對腫瘤組織樣本的分析。

　　上述成果為活細胞中復雜糖基化修飾的解析提供了經濟、便捷和有效的研究工具，有助于推動糖基化的化學酶法標記策略在蛋白糖基化的功能研究和潛在藥物新靶點的發現等方面的應用。

　　研究工作得到臨港實驗室、上海市和國家自然科學基金委員會的支持。