新鮮組織分離原代細胞

　　新鮮手術取得或凍存的組織于37 ℃ 快速復溫，原代細胞培養工作液清洗3次，盡量修剪去除纖維組織，將組織塊剪成約1 mm3大小的小塊，彎頭吸管吸取組織塊均勻種植于75 cm2 培養瓶瓶底，瓶內加入少量原代細胞培養工作液，小心翻轉培養瓶使組織塊黏附于瓶底，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養6-8 h，待組織貼壁后，正置培養瓶，補加適量培養液繼續培養。每日定時觀察細胞生長狀況，記錄細胞生長滿瓶時間，并收集培養細胞送病理學檢查。

　　①酶消化法純化腫瘤細胞：當組織塊培養15-20d后，組織塊（包括無活性的腫瘤細胞、破碎細胞和成纖維細胞等）自動脫落。取出培養瓶，棄掉培養基和漂浮的組織塊，用5 mL PBS 洗滌一次。加 1.5 mL 0.25%的胰酶，前后旋轉培養瓶4-5次，使胰蛋白酶包被所有瓶內細胞，放入37 ℃細胞培養箱中2 min。取出培養瓶在倒置顯微鏡下觀察，可見部分細胞首先變圓、脫落被消化下來，這時停止消化。這些首先被消化下來的細胞為成纖維細胞，吸除成纖維細胞及消化液。加入5 mL培養液，用吸管吹打細胞，收集細胞懸液。離心后棄上清。加入PBS 洗滌細胞沉淀，再離心棄上清，再加入培養液后接種于培養板中繼續培養。

　　 ②機械刮除法純化腫瘤細胞：用不銹鋼絲末端插橡膠刮頭或裹少許脫脂棉制成，高壓滅菌后備用。用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡下，刮除無標記空間；再用PBS沖洗1-2次，洗除被刮掉的細胞；繼續培養，如發現成纖維細胞殘留，重復刮除至完全除掉為止。