最具潛力的液體活檢技術，ctDNA甲基化測序助力腫瘤篩查

癌癥對每個人和家庭來說都是一場災難，對國家來說是一筆極大的公共衛生項目支出，根據2019年國家癌癥中心發布的中國惡性腫瘤流行情況分析報告顯示，隨著惡性腫瘤發病數持續上升，我國每年所需的相關醫療花費超過2200億元。

面對這一現狀，唯有進行腫瘤早篩，在腫瘤發生發展的源頭，將其扼殺，才能逆轉這個局面。

腫瘤早篩，國家一再強調，并發布的一系列文件，也表明了國家治理癌癥醫療問題的決心。

2019年7月，《健康中國行動（2019-2030）》中特別提出了“癌癥防治行動”。

設定了硬性的行動目標：到2022年和2030年，總體癌癥5年生存率分別不低于43.3%和46.6%；癌癥防治核心知識知曉率分別不低于70%和80%；高發地區重點癌種早診率達到55%及以上并持續提高；基本實現癌癥高危人群定期參加防癌體檢。

同年9月，國家衛生健康委等10部門聯合制定了《健康中國行動——癌癥防治實施方案（2019—2022年）》。

到2022年，癌癥防治體系進一步完善，危險因素綜合防控取得階段性進展，癌癥篩查、早診早治和規范診療水平顯著提升，癌癥發病率、死亡率上升趨勢得到遏制，總體癌癥5年生存率比2015年提高3個百分點，患者疾病負擔得到有效控制。

2021年5月24日，國務院辦公廳印發《深化醫藥衛生體制改革2021年重點工作任務》，提出：擴大高發癌癥篩查覆蓋范圍，啟動縣級癌癥篩查和早診早治中心建設試點。

腫瘤篩查尤為重要。

目前，腫瘤早篩對大部分的老百姓來說還是相對陌生。由于我國14億的人口基數，致使醫療資源顯得很是匱乏，同時由于傳統的癌癥篩查方法的局限性，例如血清學腫瘤標志物準確性低，假陽性率、假陰性率高；內鏡檢查作為一個侵入性的檢查方式，受檢者依從性低；B超、CT等影像學檢查普及度不高等一系列問題，導致我國的腫瘤篩查現狀并不理想，急切地需要一種新的腫瘤篩查手段，彌補空白。

隨著分子生物學的高速發展以及在臨床的應用越來越廣泛，以及液態活檢技術的不斷發展，液態活檢應用于腫瘤早篩成為當下最具潛力的早篩技術路徑。

液體活檢指通過對血液樣品等非固體生物組織的采集，檢測生物標志物，進而對全身進行腫瘤分析。目前液體活檢針對的生物標志物可以分為三類：

1.血液中完整的細胞，即循環腫瘤細胞（CTC）；

2.收集由腫瘤細胞釋放的外泌體（EV）；

3.分析游離的腫瘤 DNA或 RNA，如循環腫瘤 DNA（ctDNA）、循環無細胞 RNA（cfRNA）、miRNA 等。

固體與液體活檢樣品中分析物的比較

從腫瘤發生與轉移機制看，腫瘤細胞通過被動分泌（壞死或凋亡）與主動分泌釋放外泌體及 ctDNA、cfRNA 等進入血液，可在超早期探測到腫瘤信號。而 CTC 細胞的形成主要在腫瘤轉移時，腫瘤上皮細胞通過 EMT 效應轉化為具有間質表型的細胞，粘附能力減弱，失去與基底膜的連接并從原發灶腫瘤上脫落從而進入到血液系統。因此 CTC在早期腫瘤中含量較低，即使在腫瘤轉移患者中每百毫升全血中也僅有 1-10 個 CTCs，富集難度較大。同時由于 ctDNA 甲基化能夠追溯腫瘤組織來源等臨床價值，我們認為以ctDNA 為代表的液體活檢技術在腫瘤早篩領域有較大發展潛力。

腫瘤轉移與血液中的腫瘤成分

ctDNA 基因突變檢測：信號放大是痛點，已知突變檢測 PCR 足以勝任

為了追蹤腫瘤，需要區別 ctDNA 與正常 cfDNA 的區別，目前主要通過基因突變、甲基化修飾狀態、拷貝數異常，以及核小體站位等作為區分依據。基因突變是造成癌癥的根本原因之一，因此也是最先遭到檢測分析鎖定的對象。

根據 Nature Communications文獻數據，非小細胞肺癌中 EGFR（44.2%）突變，小細胞肺癌的 RB1（63.4%）突變，結直腸癌中的 APC（44.4％），KRAS（33.8％）和 PIK3CA（11.2％）突變均顯示了利用ctDNA 突變進行腫瘤篩查的潛力，ctDNA 突變也被證明與組織活檢檢測到的驅動基因頻率有強相關關系。

然而以 ctDNA 突變檢測進行腫瘤早篩的主要難度在于靈敏度難以提高。首先血液中 ctDNA 的豐度較低，10ml 全血平均包含 4ml 血漿，6000GE。

根據 Nature Genetics 數據，以 VAF（變異等位基因頻率）識別腫瘤信號檢測檢測靈敏度極限為 0.01%（即能夠檢測 12000 個拷貝中的一個 DNA 片段）。而血液中 ctDNA 的含量與腫瘤大小有關，盡管可以通過近處取樣（如采集糞便檢測結直腸癌脫落標志物）增加 ctDNA 濃度，但無技術突破或有效測序降噪手段的情況下，ctDNA 特有標記將淹沒在噪聲中，一般情況下（采集血液）對直徑 12.5mm（重量 1g）以下的腫瘤難以識別。同時由于 ctDNA 高度碎片化，半衰期短，且 ctDNA 含量在不同人間差異很大，因此需極好的富集及測序深度才能有效捕捉基因突變相關的早期癌癥信號。

此外，利用 ctDNA 突變進行腫瘤早篩的技術挑戰還包括克隆性造血與早期癌癥的定位。

根據 Nature Communications 文獻對 12377 名患者的 14972 份外周血樣本 cfDNA檢測結果，14%的樣本檢測出克隆性造血（CH）變異，涉及 15 個突變基因（最常見的是 DNMT3A、TP53 和 TET2），而黑色素瘤、膀胱癌、子宮癌和前列腺癌發生 CH 變異的頻率大于20%。同時 CH 變異頻率隨年齡增加而升高，為 ctDNA 突變的識別造成障礙。

測序方面，對 ctDNA 的測序技術主要包括 PCR 與 NGS 法，BEAMing 法、ARMSPCR 與 Tam-Seq 等則是在 PCR 與 NGS 技術的基礎上進行改進。當前對單癌種的檢測往往只需要測定部分靶點的已知基因突變，此時 PCR 由于檢測時間短、成本低、靈敏度高等優點足以勝任。NGS 法的優勢主要在于高通量，可對未知序列進行測序，但成本相對較高，在未來識別未知基因突變上或更具優勢。

ctDNA 檢測方法（部分）對比

ctDNA 甲基化測序：最具潛力的液體活檢技術路徑

DNA 的甲基化是一種表觀調控修飾，可以在不改變堿基序列的情況下參與調控蛋白質的合成。這主要是由于 CpG 島的超甲基化改變了 DNA 區域構象，影響蛋白與 DNA的相互作用從而影響轉錄效率，而啟動子區域的甲基化會使基因表達沉默。與 ctDNA 特定位點突變的模式相比，癌癥中 ctDNA 的甲基化往往發生在數以千計的 CpG 位點，更易探測和評估。同時根據張鹍教授（鹍遠生物創始人之一）于 2017 年發表在 Nature Genetics 上的研究，甲基化模式可反映特定癌癥的表觀遺傳起源，并被用于揭示未知原發性癌癥的起源組織。因此ctDNA 甲基化的檢測在靈敏度和定位癌癥位置兩方面均強于對基因突變的檢測。

傳統的 DNA甲基化測序其一是通過甲基化 DNA 結合蛋白（MBD）或甲基化抗體（MeDIP）進行捕獲測序以獲得全基因組內 100-1000bp 分辨率的甲基化信號，然而無法獲得單堿基分辨率信號；其二簡化基因組甲基化測序（RRBS）利用限制性內切酶富集CpG 區域可獲得部分基因組單堿基分辨率信號；全基因組甲基化測序（WGBS）則利用亞硫酸氫鹽（BS）將非甲基化的 C 轉為 U，之后通過簡單地測序即可獲得甲基化修飾信號。盡管 WGBS 兼顧了全基因組測序和獲取單堿基信號的優點，但 BS 轉化屬于極端環境，對 DNA 損傷極高，易出現單雙鏈混合、缺刻、缺口損傷等現象，可造成約 90%的DNA 模板丟失，因此其建庫起始量很高，且有效數據量低（為獲得 30X 的測序深度需高達 230Gb 左右的測序數據量，冗余率過半）。盡管后續通過一系列引物設計、建庫優化等方法可對 WGBS 測序進行優化，但應用于臨床仍有較大缺陷。

考慮 ctDNA 甲基化標志物的驗證技術手段，目前一方面甲基化檢測在靶向捕獲技術進步的推動下在靶向測序平臺（PCR 與雜交捕獲）已實現較好的商業化，另一方面針對甲基化的 BS-free 測序技術正逐步實現突破。我們認為甲基化檢測的靶標選擇、測序技術等仍是癌癥早篩企業的壁壘之一，未來技術突破有望提升測序準確度，更精準識別甲基化信號。

甲基化測序方法對比

從當前已商業化基于 DNA 甲基化生物標志物的產品看，部分甲基化靶點如 SEPT9、MGMT 等已成為明星靶點。如 FDA 批準 Epigenomics 公司的結直腸癌早篩產品 EpiproColon 后，國內 NMPA 隨后批準了博爾誠（引進 Epigenomics ZL）、為真生物、透景生命的 SEPT9 甲基化檢測試劑盒，均為輔助診斷用途。韓國 Genomictree 公司適用于結直腸癌，檢測 SDC2 甲基化的產品 EarlyTect 于 2014 年獲 KFDA 批準后，國內康立明生物、艾德生物的 SDC2 甲基化檢測也隨后獲 NMPA 批準（同樣為輔助診斷用途）。由此可見，當前海外已獲批靶點的甲基化檢測產品國內較易獲證并推動商業化，但單靶點的甲基化檢測產品較難獲批早篩用途，而僅作為金標準檢查的輔助診斷手段。

隨著ctDNA 甲基化測序等液態活檢技術的不斷發展與完善，作為一種無創無痛的篩查方式，在未來腫瘤早篩領域極具競爭力。