李昌厚：保證分析檢測數據可靠性的一些關鍵問題（二）

　　在上一篇文章中，我們講解了3個影響檢測數據可靠性的關鍵問題，在本篇中，李昌厚老師繼續為讀者講解剩余4個影響檢測數據可靠性的關鍵問題。

重視和掌握數據處理和數據可靠性判斷的具體方法

　　加標回收率的測定

　　由于工作中樣品溶液與標準溶液基體一致是很難做到的，基體中有無干擾可以通過加標回收實驗確定：即在被測樣品中加入標準物質，測定其回收率，這是目前國內外各種實驗室中常用而又方便確定檢測數據可靠性（準確度）的方法。但是，加標回收仍需要注意以下幾個問題：

　　1）若樣品濃度小于測定下限時，則加入測定下限（標準系列濃度最低點）的濃度，否則無效。

　　2）作標準曲線時：實驗點不少于5個點(最好7個點)，有人只做3個點不妥，太少了。

　　3）加標回收時需要加3個水平的添加量，因為回收率視含量不同而有差異。加標點的位置應該是三個（線性范圍的兩端各一點、線性范圍中間取一點）。

　　重視相關系數r與斜率b的關系，避免誤判分析測試數據的可靠性

　　從儀器學理論和分析化學的角度來看，我們平日所講的標準曲線又稱校正曲線，其理論依據是郎伯－比爾定律。即：

A=KLC

　　式中：A為吸光度；K為系數；L為光程；C為試樣濃度。

　　現代分析儀器自動化水平都較高，都帶有計算機及配套軟件。在測定標準濃度溶液后，都能通過計算機自動獲得相應的吸光度，根據回歸方程y=bx+a，自動給出校正曲線及校正曲線的相關系數（r）、斜率（b）和截距（a）。但吸光度A與試樣濃度C之間的關系A=f(C)只是相關關系，只有當r≈1時，吸光度A與試樣濃度C之間的關系才可近似地看作線性函數關系，最終根據測得的樣品吸光度A值直接由A=f(C)反求試樣濃度C值。當r偏離1較大時，則根據測得的吸光度A值直接由A=f(C)反求試樣濃度C值將產生較大的誤差。所以，注重 r 這個重要數據是對的。

　　但是，許多科技工作者只是單一的注重 r 這個重要數據，專門追求r值的大小，并且主要根據r值來對檢測結果下結論，這就不對了。他們只看r值達到了幾個“9”，并且很多科技工作者片面追求相關系數是否達到三個9以上：他們認為r值達到0.999,就算測定結果準確了。這是不對的，為什么？因為多數實驗室忽略了斜率的變化。測定中的吸光度是隨濃度的變化而改變的，如果濃度不準確，如標樣濃度變小，吸光度也隨之變小,反之亦然。根據回歸方程y=bx+a,斜率b增大,吸光度也隨之增大。所以即使相關系數好，測定結果也不一定準確。往往在接受質控考核中會遇到這個問題，我們應引起重視。

　　例如，測定水中的Mn時，作者和鄒宗富等參加國家實驗室比對考核時，測試結果雷同：三個實驗室對Mn的測試時，相關系數都在0.9996以上，儀器都是使用國產TAS-990，國家給定的標準參考物質濃度：0.16±0.02 μg/mL，三個實驗室用TAS-990測定Ｍn的結果：1、2實驗室考核合格；3實驗室考核不合格。三個實驗室測定結果如下表：

　　表中所示，三個實驗室測試結果中，r值都為三個“9”，但是斜率在第三個實驗室的測試數據中不正常。最后導致測試結果的濃度也不正常。致使第3個實驗室考核不及格。所以r值不能完全代表實驗的有效性。

　　重視測量方法與測量結果的朔源

　　測量方法至少包括抽樣，樣品前處理和儀器測定三個部分組成。除樣品的代表性（送樣只對送樣負責、采樣對批量負責）、合理的前處理外，還要朔源儀器的檢定。當對某樣品測定時，無論選用哪種分析方法，都要用化學組成形態與樣品相似的標準參考物質同時進行測量，只有標準參考物質的測量結果在證書值給定范圍內，才能說明測量結果的可靠性。這也說明了標準參考物質的重要性。

　　重視標準和標準系列濃度范圍的關系

　　據分析儀器（儀器學理論）和儀器分析（分析化學理論）的理論，很多分析都是相對測量，所以標準特別重要。一般情況下，要求試樣濃度應盡量在標準系列的中間。例如食品等需要消解的樣品，根據衛生部食品標準方法，AAS石墨爐法測Pb的標系為：10～80 ng/mL。若稱樣量2 g，經微波消解后定容為10 mL待測，測得的樣品Pb的含量，按衛生部標準計算則為0.2（μg）×2（樣品量）/10 mL=40 ng/mL。這個結果很好，在標系范圍內，并且在標系中間。

　　注重樣品測定值與標準值不一致時的處理判斷方法

　　任何分析檢測工作的結果很容易引入誤差，測定值往往與真實值不同。因此，一定要重視這些誤差對測定結果可能產生的影響，并要控制在一個很小范圍內。例如：測定水中的Pb，其測定值為11.0 ng/mL；采用生活飲用水國家衛生標準（10.0ng/mL）衡量，則11.0 ng/mL超標。但是若對10 ng/mL的Pb標準溶液，進行多次測定，其濃度可能在8.0～12.0 ng/mL范圍內變化，從測定誤差考慮，飲用水中的Pb也可認為11.0 ng/mL不超標，也可以判定合格。所以分析測試工作者對數據的分析和處理結論都很重要。

　　不同方法的比較

　　1)當采用不同分析方法對同一樣品進行重復測定所得結果一致，則檢測數據可靠。

　　2)采用不同類型儀器（紫外、液相；AAS、滴定等）對同一樣品進行重復測定所得結果一致，則檢測數據可靠。

　　3)同一類型的不同儀器（例如不同型號的液相、不同型號的紫外等）對同一樣品進行重復測定所得結果一致，則檢測數據可靠。

　　4)用統計學方法檢驗.統計檢驗表明，多次測試結果其差異不明顯時（或數據在誤差要求范圍內時），則可認為測試數據可靠。

　　有些分析工作者在調試國產儀器時，經常使用進口儀器的測試數據來作參照。但他們并不注意比較儀器的檔次、儀器的測試條件、被測試樣的情況。例如在驗收某國產紫外儀器（國產某1901型紫外分光光度計）時，相關方要求一定要用三個月以前、曾用某進口儀器（進口Cary5000型紫外分光光度計）驗收測試時用過的樣品來做比較。然而，該國產儀器廠商的工程師不清楚進口儀器的型號、檔次、測試條件，而且相關方也不提供用于做對比的進口儀器技術指標，只強調國產儀器測試數據、譜圖一定要與進口儀器測試的數據和譜圖完全一致才行。經過多次調試、檢測，這臺儀器還是不能達到相關方的要求。

　　后來，經咨詢作者并與相關方討論協商，最終提出了具體解決方案：一是重新配置同樣的樣品測試，二是找到原進口儀器比對測試。應作者要求，在找到原比對的進口儀器后、在同樣條件下，用這臺進口儀器當場再測試存放三個月之久的樣品，最終檢測結果與該進口儀器原來測試的數據、譜圖完全不同，但與當時參與驗收的國產儀器現場測試結果（數據、譜圖）完全一致。為什么會產生這個現象呢？因為試樣放置了三個月，已發生化學變化，自然不可能與三個月以前的測試結果相同。

　　還有一些藥物分析工作者或藥檢工作者，他們根據藥典要求進行藥品中重金屬元素（致癌物質）的分析檢測，并將某些藥品在AAS儀器上得到的數據與藥典上要求的數據相比較來考核儀器性能。然而，他們并嚴格不按照藥典的要求來配制或處理試樣，一旦發現數據不符就下結論說儀器不好，這也是不妥的。為什么？前面說過，試樣的處理、配制（稱樣、量具、溶劑）對分析測試結果有很大影響，如果不注意認真處理試樣，極易導致測試數據誤差的產生。此外，在儀器條件方面，雖然藥典（標準）上有明確的檢測方法要求，但是有時藥典（標準）未講明具體儀器條件。因此，一旦發現檢測數據與藥典（標準）不符時，還要認真改變儀器條件后反復測試，這樣才能得出正確的結論。

　　曾經某醫院一位醫務工作者要買一臺國產專用AAS來測試Cu、Zn、Ca、Mg、Fe，招標時有兩家同類國產儀器廠商競爭。為了挑選一臺好的儀器，該醫院提出要求將這兩款專用儀器（價值僅幾萬元RMB/臺）的測試數據與美國PE公司AA-800（價值超過80萬RMB/臺）檢測的數據與進口AAS儀器比較，哪臺儀器測試數據與進口品牌儀器最接近就買哪臺儀器。而巧合的是進口AA-800正處在故障階段（穩定性不好），并且還尚未修復，所以這種比較是不妥的，比出的結果是不正確的。

　　作者在這里再次強調，也懇請大家記住：比較檢測結果時，一定要同類、同檔次的儀器才可以比較，不能用低檔的751UVS測試數據與中、高檔儀器TU-1901、Cary6000i的測試數據比較。同樣，也不能將一臺行業專用AAS儀器測試數據與進口通用高端AA-800檢測數據來比較。這個問題應該怎樣解決？作者認為：如果這位醫務工作者自己配制一個樣品，對他來講是已知的試樣，而對這兩家國產儀器的競爭者是盲樣，將這兩款儀器分別對該樣品進行測試，看誰的數據與實際值最接近，然后在再綜合評價儀器，誰的測試結果好就買誰的儀器，這才是正確的做法。

重視理解儀器性能指標對分析誤差的影響

　　這是所有分析檢測工作者必須注重的問題，也是保證分析檢測數據可靠性好的最重要的問題之一。作者列舉如下幾個要點，便于讀者理解：

　　正確理解精度、精密度和準確度的關系

　　精度、精密度、準確度這些指標大家經常用到，但是很多人仍搞不清他們的關系。有的科技工作者講：“分析檢測儀器中沒有準確度一說”；有人認為“精密度或重復性就是準確度”。這些都是錯誤的概念。精密度或重復性是指的多次測量中的離散性，如：3次或5次測量結果中，最大值與最小值之差即為重復性。精度包含準確度（Accuuracy）、精密度（Precision），這個問題大家也經常模糊不清。準確度則是指實際測量的值與真值或理論值之差，精密度表征重復性或離散性，一般取平均值表示。精密度和準確度是完全不同的兩個概念。Owen[9]為了說明準確度和精密度或重復性的區別，為了澄清國際上的錯誤觀念，用打靶的例子作了精辟的說明，詳見下圖所示：

　　圖中：(a)－精密度和準確度都不好；(b)－精密度好，準確度差；(c)－精密度差，但準確度好；(d)－精密度和準確度都好；又可叫“精度”好。

　　檢測限（又叫檢出限）、靈敏度和測定限問題

　　檢測限是表征儀器檢測能力的指標，表征儀器的靈敏度。可以指明對某個物質的最小檢測量（如HPLC對萘的檢測限為10-9 mg/mL等），也可用S/N表示，一般用S/N=2為定性檢測限。而定量檢測時，有人用S/N=10表征檢測限；但是一般用S/N=3（我國很多標準規定用S/N=2），也有用3倍標準偏差作為檢測限的。測定限是指能測出的數據，與N無關。檢測限和測定限的區別如下圖：

　　標準偏差SD（也可以用σ表示）和相對標準偏差RSD

　　它們是廣大分析檢測科技工作者使用最多一個指標，用于表征分析檢測的離散性或重復性。但是在具體應用時，很多科技工作者的操作不規范。有人作3次平行數據、有人作5次平行數據，這些都是不妥的。作者認為，做SD測量時應該至少作6次以上，所以有些標準規定平行數據不得少于6次就是這個道理。

　　相對標準偏差RSD是指在同一條件下，對同一試樣多次重復測量，測量結果相互符合的程度或離散性，又叫精密度或重復性。

　　精密度通常用統計方法來計算；如：對于同一試樣，在相同條件下進行多次測量，測出某值Xi，并求出多次測量的平均值X：

　　此時，標準偏SD（又可以用σ表示）可由下式求得：

　　式中的σ為標準偏差；n為測定次數， Xi 為第i次測量的值。 X為多次測量的平均值。此時，相對標準偏差一般慣用RSD表示： RSD＝SD/X′100％

　　當我們的測量次數足夠多的時候，SD 遵循高斯定律，SD獲得的正負次數大約相等，因此，分析測定的標準偏差也可以用 ±SD 表示。但是作者認為還是不加“±”為好。分析檢測人員正確理解和正確運用這些檢測儀器的性能技術指標，是用好一臺檢測儀器的關鍵，或者說是得到準確可靠分析檢測數據的關鍵。希望廣大讀者重視這些指標的物理意義的理解，重視對這些指標的自檢方法，正確選擇和運用這些技術指標。這樣才能真正用好檢測儀器，保證分析檢測數據的可靠性，真正的成為一名合格的檢測人員。

重視日常分析檢測工作中分析數據處理的常見錯誤

　　在日常的分析檢測報告中，經常出現表述不妥當或者不規范的現象，大家應該引起重視。

　　檢出結果為“0”、“未檢出”

　　測試結果的表述與測試方法、標準、儀器條件等有關，如果有些國標、行標、企標設定標準為0.003 μg/mL，此時檢測報告中的“0”和“未檢 出”應寫“低于0.003 μg/mL”，絕對不能寫“檢出結果為0”和“未檢出”。如果沒有國標、行標、企標，檢測人員根據當時的方法、使用儀器型號、選擇儀器條件，經過認真檢驗和判斷，在報告中寫上檢測結果。如果真的檢測不出來，可以在報告中寫低于儀器檢測限（但應給出具體數據：如使用某HPLC，其檢測限為萘1.0×10^-8 g/mL。此時，對萘的檢測報告中可寫：低于1.0×10^-8 g/mL。但是絕對不能寫“未檢出”或“0”）。

　　AAS數據處理值得高度重視

　　在驗收AAS時，經常出現驗收單上有指標驗收標準值，但沒有驗收實測值和結論的現象。例如：有人在驗收TAS-990F時，用Hg燈的特征波長來測試儀器的波長準確度。他選用三條特征波長：253.7 nm、546.1 nm、871.6 nm，這是對的。然而在“驗收實測值”欄里卻有9個實測數據，它們是：253.84 nm、253.85 nm、253.85 nm、546.19 nm、546.19 nm、546.20 nm、871.64 nm、871.64 nm、871.65 nm。那么問題出在哪里？第一，標準值（或要求值）只要求小數點后一位（253.7 nm、546.1nm、871.6nm），但實測值為小數點后兩位數字（例如：253.84…）；第二，沒有結論。在驗收實測值這欄中，應該對9個數據進行數據處理（例如取均值），最終得出一個實測結論，最后填寫驗收實測值的結論值。在這個案例中，結論值應該是±0.2 nm。所以大家一定要重視數據處理這一問題。

　　很多日常的檢測報告中，不注明工作環境條件

　　例如，我國南方在室溫為8℃和30℃時進行測試時，得到的數據是不同的。此外濕度的大小也會影響實際檢測的數據。這些細節問題，往往是很多分析測試科技工作者所忽略的，作者認為應該引起實驗室管理人員以及檢測人員的重視。

重視測定條件選擇對測定結果的影響（對誤差的影響）

　　根據儀器學理論，針對不同儀器和不同樣品，分析測試人員要選用不同儀器分析條件進行分析，否則誤差容易增大。例如火焰AAS有36個條件需要選擇，包括選擇燈電流、光譜帶寬、乙炔流量、燃燒頭高度、積分時間等。選用石墨爐AAS法測定時，有48個條件需要選擇，可選則參數包括燈電流、光譜帶寬、干燥溫度、灰化溫度、原子化溫度、升溫速率、保留時間、凈化階段的溫度與時間、積分時間等。

　　上述這些條件都對分析測試結果的誤差有絕對影響。所以，相關操作人員一定要從儀器學（理論）和分析化學（實踐）兩個角度，認真注意選擇分析條件。作者根據多年經驗，為讀者舉一個實際檢測的例子：一般來講，測定鐵、錳等元素的光譜帶寬要求小于或等于0.2 nm，測定鉻、錫時，乙炔流量要大一些，一般采用還原性火焰，空心陰極燈發射譜線的光斑要在燃燒頭縫隙的正中，且有3～4 mm的距離。在石墨爐法中，除正確選擇干燥溫度、灰化溫度、原子化溫度、凈化溫度等條件外，還要注意標準溶液與樣品溶液的濃度，要注意按樣品溶液的特點選擇最適宜的檢測條件。

　　另外，對測定高濃度（濃度在標準系列濃度直線以外，例如:2～4 ng/mL以上）的鈉、鉀、鋅等樣品時，要適當轉動燃燒頭的角度，并且將高濃度的吸光度控制在0.2～0.5 Abs最佳值以內（即在儀器的線性范圍內），其目的是為了控制或減少分析誤差。

　　從儀器學理論和分析化學的實踐要求來講，光譜、色譜等儀器的檢測條件選擇非常重要^[2]。很多研究證明，UVS、AAS、HPLC等儀器的條件選擇對最終的檢測結果又顯著的影響^[4、6、8]，作者認為所有人必須認真對待。例如，在SBW分析條件選擇上，我國藥典過去規定檢測青霉素鈉等要用1nm光譜帶寬。作者對此進行了研究；先后用1.0nm 、0.5 nm、0.3 nm、0.1 nm的SBW測試，結果使用0.3 nm的SBW，測量峰值最高。后來作者報告國家質量技術監督局并提出建議，希望邀請儀器研究和應用領域專家參加制訂藥典。經過專家研究，最終在新版藥典中去掉了1nm光譜帶寬的規定。

　　此外，儀器操作人員特別要重視操作程序，不能著急。作者曾經培養的一位博士生在做AAS分析檢測時，在冷卻時間還沒到時，馬上又進樣…。結果表面上他的實驗完成最快，但實際數據不合格，只能重做。不僅沒能在最短時間內得到檢測數據，還浪費了寶貴的實驗時間。雖然實驗技巧大家都知道，但也要重視實驗操作程序，順利完成樣品檢測。

重視開展分析測試方法學的研究

　　由于科技創新發展很快，很多工作可以在電腦軟件上下功夫，最終得到令人滿意的結果。例如：北京西派特的科技工作者，針對任務開展拉曼光譜數據處理的算法研究，得到了滿意的效果。西派特應用測試部都是年輕人，并且全部是分析化學背景的技術人員。他們結合任務，大力開展軟件算法研究，結果得到了令人想像不到的結果。請看下面的例子^[8]：

　　1. 北京西派特公司在算法上創新、性能實現國際領先水平的EXR510便攜式激光拉曼光譜儀實際樣品測試譜圖：

　　（1）數據采集和降熒光、降噪處理的結果（譜圖）

　　由于算法上的創新，其效果令人非常滿意。這種做法值得引起廣大使用者重視。

　　儀器條件：ExR510 便攜拉曼光譜儀； 激發光源：785 nm； 積分時間：10 s；功率等級：10級。

　　（2）對滑石粉、布洛芬等樣品進行定性檢測的結果：

　　從采集光譜圖、降熒光干擾、降噪聲、與標準譜庫自動比對等，最后給出匹配度結果，檢測過程全部由儀器自動完成。據文獻報道，滑石粉是一種拉曼信號很弱的樣品。即便如此，該儀器采用了降噪、降熒光干擾的方法，檢測匹配度達到99.9%，定性檢測的譜圖如下：

　　①滑石粉定性檢測的結果：滑石粉 檢測的匹配度：0.999

　　②布洛芬片定性檢測的結果：布洛芬 檢測的匹配度：0.928

　　檢測儀器：ExR 510 便攜拉曼光譜儀；

　　激發光源：785 nm；積分時間：10s ；功率等級：10級

　　③對多組分樣品進行定量分析檢測的結果：

　　樣品是西派特公司自己配制的；由15mL甲醇、30 mL乙醇和15mL乙二醇混合而成。以此作為已知相對標準樣品，測出的結果如下表所示：

　　為了說明開展算法研究的重要性，作者采用了國產西派特ExR510拉曼光譜儀與美國海洋光學 Accuman PR-500拉曼光譜儀同時對三種同樣輔料試樣，在相同測試條件下測試的結果如圖所示：

上圖為美國海洋光學Accuman PR-500測試的結果

上圖為中國西派特公司ExR510的測試結果

上圖為中國西派特公司 ExR 510對測試譜圖進行降噪聲、降熒光處理后的結果

　　經過比對，作者認為由于算法的創新，西派特公司的ExR510激光拉曼光譜儀與目前國內外其它同類產品相比較，具有獨到之處。其主要性能指標優于國外同類同檔次的產品。所以，開展方法學研究、認真選擇儀器條件非常重要，是目前國際上分析儀器及其應用領域的一種潮流，也是當前分析方法創新的潮流，值得廣大分析檢測科技工作者關注。

　　主要參考文獻

　　[1]李昌厚，《原子吸收分光光度計儀器及其應用》 ，北京：科學出版社,2006

　　[2]李昌厚，《儀器學理論與實踐》，北京：科學出版社,2008

　　[3]李昌厚，《高效液相色譜儀器及其應用》，北京：科學出版社,2014

　　[4]李昌厚著，《紫外可見分光光度計》 ，北京:化學工業出版社,2005

　　[5]李昌厚，《紫外可見分光光度計儀器及其應用》，北京:化學工業出版社,2010

　　[6]李昌厚，用好AAS的一些關鍵問題，分析測試百科網，2020年6月

　　[7]李昌厚，用好HPLC的九大關鍵問題，儀器信息網，2020年6月

　　[8]李昌厚，便攜式激光拉曼光譜儀器及其應用的最新進展，儀器信息網，2019年6月

　　[9]A.Owen ,The diode-array advantage in UV/VISS,Hewllet Packrd,PrinnTED in Germany,03/88,p15.

　　作者簡介

　　李昌厚，男，中國科學院上海生物工程研究中心原儀器分析室主任、兼生命科學儀器及其應用研究室主任、教授、博士生導師、華東理工大學兼職教授，終身享受國務院政府特殊津貼。

　　主要研究方向：長期從事分析儀器研究開發和分析儀器應用研究。主要從事光譜儀器（紫外吸收光譜、原子吸收光譜、旋光光譜、分子熒光光譜、原子熒光、拉曼光譜等）、色譜儀器（液相色譜、氣相色譜等）及其應用研究；特別對《儀器學理論》和分析儀器指標檢測等方面有精深研究；以第一完成者身份，完成科研成果15項。由中科院組織專家鑒定，其中13項達到鑒定時國際上同類儀器的先進水平，2項填補國內空白；以第一完成者身份獲得國家級和省部級科技成果獎5項（含國家發明獎1項）；發表論文183篇，出版專著5本；曾經任中國儀器儀表學會理事、中國儀器儀表學會分析儀器分會第五屆、第六屆付理事長、國家認監委計量認證/審查認可國家級常任評審員、國家科技部“十五”、“十一五”、“十二五”和“十三五”重大儀器及其應用專項的技術專家組成員或組長、上海市科學儀器專家組成員、《光學儀器》副主編、《生命科學儀器》付主編、《光譜儀器與分析》副主編、上海化工研究院院士專家工作站成員等十多個學術團體和專家委員會成員等職。