條件性恐懼實驗毛冬青改善血管性癡呆小鼠學...（一）

條件性恐懼實驗-毛冬青改善血管性癡呆小鼠學習記憶作用的研究

摘要:

目的:觀察毛冬青提取物對血管性癡呆(V D)模型小鼠學習記憶能力的影響，探討其潛在的作用機制。

方法:采用反復夾閉、再通雙側頸總動脈同時尾靜脈放血的方法制備小鼠癡呆模型，隨后將小鼠隨機分為假手術組，模型組，尼莫地平對照組(30mg/kg)，毛冬青低、中、高劑量組(5,  10,  20 g/kg)，各組灌胃相應藥物10 mL/kg，連續35 d，從第30天開始進行行為學檢測，末次給藥后收集大腦樣本，HE染色觀察病理學變化、免疫組化法及W esten Blot法檢測Bcl-2/Bax蛋白表達。結果與假手術組比較，模型組小鼠的恐懼記憶時間明顯縮短，大腦海馬區神經元細胞病變嚴重，海馬區Bcl-2/Bax蛋白表達的比值降低，且主要分布于胞質。與模型組比較，各藥物組小鼠的恐懼記憶時間明顯延長，大腦海馬區的組織病變情況改善，且海馬區Bcl-2/Bax蛋白表達的比值顯著增加。

結論:毛冬青提取物可能通過上調Bcl-2蛋白表達，下調B ax蛋白表達，減少細胞凋亡，保護神經細胞，從而改善血管性癡呆小鼠的學習記憶功能。

關鍵詞:毛冬青提取物;血管性癡呆;學習記憶能力;細胞凋亡

隨著全球老齡化的出現，慢性疾病癡呆越來越引起人們的關注。其中，血管性癡呆是繼阿爾茨海默病之后誘發老年期癡呆的第二大病因Czl，也是目前唯一可以預防的腦退化疾病類型。因此，研發有效預防及治療VD的藥物具有重要的意義。毛冬青為冬青科冬青屬植物毛冬青的干燥根或葉，是我國南方常用中藥，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒等功效，大量研究表明，毛冬青的各類制劑對冠心病、腦血栓、血栓性脈管炎等心腦血管疾病均有顯著療效。本研究通過觀察毛冬青提取物對血管性癡呆小鼠學習記憶、海馬區病理變化及凋亡相關蛋白表達的影響，探討毛冬青改善血管性癡呆學習記憶的可能作用機制，為中醫藥防治VD提供實驗依據。

1材料與方法

1.1動物KM種小鼠，雄性，SPF級，體質量32一35 g，由廣東省實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(粵)2013-0002。實驗動物喂養環境:溫度23一25℃;相對濕度(50士5)%，常規飼料飼養。

1.2藥物及主要試劑 毛冬青飲片分別購于康美藥業股份有限公司和廣州大翔藥業有限公司，經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室黃海波教授鑒定為毛冬青植物Ilex pubescens Hook. et. Arn.。取毛冬青飲片300g，粉碎成粗粉，加入60%乙醇加熱回流提取2次，依次用6倍量和4倍量溶媒分別提取1.5 h和1 h,濾過后合并藥液，減壓濃縮至150 m L，即得PHRE儲備液，用時以蒸餾水稀釋至所需濃度。

尼莫地平片，拜耳醫藥保健有限公司，批號:BJ24208;  SABC免疫組化染色試劑盒，博士德生物，批號:11C29C。p-actin抗體，b iow orld，批號:AP0060。 Bcl-2抗體，abeam，批號:ab182858。B ax抗體，abeam，批號:ab32503。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔工所lg（H十L），北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號:III-0011;

1.3儀器

A U M 220D電子分析天平，日本S h in ad zu公司;超低溫冰箱，美國Thermo公司;制冰機，日本Sanyo公司產品;高速冷凍離心機，中國中科中佳科技儀器有限公司;多功能酶標儀，美國P erk iti E lm er公司;CM 1950冰凍切片機， A SP200S脫水機，E G 1160包埋機，RM 2135切片機，ST5020染色機，D C 300光學顯微鏡，均為德國Leica公司;小鼠條件恐懼試箱、X R -XC404條件性恐懼分析系統，上海欣軟科技有限公司。

1.4分組、模型制備及給藥

取雄性KM種小鼠，采用頸總動脈結扎反復缺血再灌注的方法制備經典VD模型:小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL}kgl)全身麻醉，分離雙側頸總動脈，用動脈夾阻斷其血流30 min，松開動脈夾恢復血流10 m in，重復3次。于第1次阻斷血流5min后，小鼠斷尾放血約0.3 m L，冷凝止血。第3次血流再灌注后30 min，觀察小鼠呼吸、心跳，待其正常后即可縫合皮膚。假手術組小鼠僅暴露雙側頸總動脈同等時間即可縫合皮膚。造模后第2天，除假手術組外，將模型小鼠隨機分為5組，分別為模型組，尼莫地平對照組(30 mg/kg),  PHRE低、中、高劑量組(含生藥量5,  10,  20 g/kg }，每組12只。各組小鼠按l0mL/kg灌胃給藥，連續35 d，每天1次，假手術組及模型組灌胃等體積的蒸餾水。

1.5行為學檢測

1.5.1爬桿實驗 第30天給藥后2h，進行爬桿實驗測試。將一根長50 cm、粗1.5 cm的竹竿固定在泡沫盒上，竹竿用紗布包裹以防打滑，小鼠頭朝下放置于竹竿頂部，記錄小鼠爬完桿長全長所需時間。正式記錄評分之前，訓練小鼠爬桿3d，每日1次，確保每只小鼠學會爬桿。根據爬桿時間進行評分，若小鼠墜落評7分，不動評6分，40 s掉頭評5分，20 s掉頭評4分，爬完全長31一40 s者評3分，21一30 s者評2分，11一20 s者評1分，0一11 s者評0分。

1.5.2條件恐懼實驗 

給藥34 d后進行條件恐懼實驗，實驗分為兩個階段，第一階段為恐懼訓練階段，即第34天給藥2h后，將小鼠放入恐懼箱中，從20 s開始給予聲刺激(75 dB ,  2000 H )，持續10 s，從25 s開始給予光刺激，持續5s，從28 s開始足部電刺激((0.8 m A) 2 s。共進行4個循環，間隔時間各為15 s。第二階段為測試階段，即第35天給藥2h后，將小鼠放入恐懼箱中，場景與受訓階段場景一致，提供相同的聲、光等提示性信號，但不給予電擊，動物仍將會表現出恐懼反應，通過觀察動物的僵直時間來反映動物對恐懼的記憶能力。