校準曲線

校準曲線包括標準曲線和工作曲線，前者用標準溶液系列直接測量，沒有經過預處理過程，這對于樣品往往造成較大誤差；而后者所使用的標準溶液經過了與樣品相同的消解、凈化、測量等全過程。
凡應用校準曲線的分析方法，都是在樣品測得信號值后，從校準曲線上查得其含量（或濃度）。因此，繪制準確的校準曲線，直接影響到樣品分析結果的準確與否。此外，校準曲線也確定了方法的測定范圍。 1.校準曲線的繪制
用一系列被測物標準溶液，按照標準方法規定的步驟，將被測物轉變為有色溶液。制備好的標準系列和空白，在方法選定的波長下，測定吸光度。已被測物濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制校準曲線。
1)對標準系列，溶液以純溶劑為參比進行測量后，應先作空白校正，然后繪制標準曲線；
2）標準溶液一般可直接測定，但如試樣的預處理較復雜致使污染或損失不可忽略時，應和試樣同樣處理后再測定。
3）校準曲線的斜率常隨環境溫度、試劑批號和貯存時間等實驗條件的改變而變動。因此，在測定試樣的同時，繪制校準曲線最為理想，否則應在測定試樣的同時，平行測定零濃度和中等濃度標準溶液各兩份，取均值相減后與原校準曲線上的相應點核對，其相對差值根據方法精密度不得大于5%～10%，否則應重新繪制校準曲線。

 2. 校準曲線的檢驗
  1）線性檢驗: 即檢驗校準曲線的精密度。對于以4～6個濃度單位所獲得的測量信號值繪制的校準曲線，分光光度法一般要求其相關系數 | r | ≥0.9990，否則應找出原因并加以糾正，重新繪制合格的校準曲線。
  2）截距檢驗：即檢驗校準曲線的準確度，在線性檢驗合格的基礎上，對其進行線性回歸，得出回歸方程 y= a+bx ，然后將所得截距a與0作t檢驗，當取95%置信水平，經檢驗無顯著性差異時，a可做0處理，方程簡化為y= bx，移項得x=y/b。在線性范圍內，可代替查閱校準曲線，直接將樣品測量信號值經空白校正后，計算出試樣濃度。
當a與0有顯著性差異時，表示校準曲線的回歸方程計算結果準確度不高，應找出原因予以校正后，重新繪制校準曲線并經線性檢驗合格。在計算回歸方程，經截距檢驗合格后投入使用。
回歸方程如不經上述檢驗和處理，就直接投入使用，必將給測定結果引入差值相當于解決a的系統誤差。
3) 斜率檢驗: 即檢驗分析方法的靈敏度，方法靈敏度是隨實驗條件的變化而改變的。在完全相同的分析條件下，僅由于操作中的隨機誤差導致的斜率變化不應超出一定的允許范圍，此范圍因分析方法的精度不同而異。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相對差值小于5%，而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小于10%等等。

3. 校準曲線的控制
被測物轉變為有色溶液的反應稱為顯色反應或發色反應。顯色反應的介質PH條件、顯色劑用量、顯色反應的時間和溫度、為消除共存物干擾而加入的掩蔽劑、甚至加試劑的順序，都要按照方法步驟的要求執行。有時，標準系列雖然不像實際試樣那樣組成復雜，但仍要求與試樣進行同樣的處理步驟，以便控制校準曲線上的數據點的空白、回收率等因素。
建立校準曲線時，測量吸光度的參比有兩種選擇。
第一種方法用純溶劑作參比，兩個比色皿都放溶劑時，“樣品比色皿” 的吸光度測定值為比色皿成對性校正值，此后所有樣品吸光度測定值都須扣除此值，進行校正。然后，以純溶劑為參比，測定空白及標準系列的吸光度，繪制校準曲線。
第二種方法直接用空白為參比。當兩個比色皿都放空白時，測定比色皿成對性校正值，然后測定標準系列的吸光度，繪制校準曲線。兩種方法得到的兩條校準曲線互相平行，但第一種方法可測定空白的水平，后一種方法不能測定空白，理論上校準曲線通過原點。若空白為零，兩條校準曲線重合。無論用什么作參比，實樣測定時應該使用與建立校準曲線相同的比色皿和同樣的參比。
比色皿的成對性校正對于使用已久的比色皿是必要的，尤其是測量吸光度很小的樣品時，校正可保證測量值的可靠性和重復性。