核酸凝膠電泳1

核酸是帶均勻負電荷的分子，在電場中向正極移動，不同大小和構象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動時，各核酸分子的遷移率區別很小，難以分開。以適當濃度的凝膠介質作為電泳支持介質，具有分子篩效應，使得分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現較大差異，達到分離的目的。此為分離、鑒定、純化核酸片段的標準方法。用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）進行染色，可直接在紫外燈下確定DNA在凝膠中的位置。
一、影響核酸電泳的因素
1、核酸的性質
核酸的電荷量，分子大小，分子的空間構象等決定了不同的核酸分子具有不同的遷移率。對于線狀雙鏈DNA分子，在凝膠電泳中，分子量的常用對數與泳動率成反比關系，一般雙鏈DNA基本上不存在影響遷移率的復雜構象，但分子的空間構象也影響泳動速率，如分子量相同的質粒DNA 遷移速率則是：閉環型>線性>單鏈開環型。
對于單鏈RNA或DNA，其在凝膠電泳中的遷移率受堿基組織和序列的影響，同等大小的核酸可能由于空間構象不同而使遷移率不同，故可利用變性凝膠電泳分離純化單鏈核酸。
2、凝膠孔徑的大小：
瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝膠電泳常使用的支持材料，通過兩種支持介質的濃度變化調整所形成凝膠的分子篩網孔大小，能分離不同分子量的核酸片段，瓊脂糖凝膠的孔徑大，分辨率低，但分離范圍廣，約100bp~50kb的DNA；PAG的孔徑小，分離小片段（5~500bp）DNA效果較好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。凝膠孔徑的大小是影響核酸在凝膠電泳中遷移率的最基本因素 它決定了能被分離的片段的大小。下表列出不同凝膠濃度與其分離DNA分子大小的范圍。

*指遷移率與染料相同的雙鏈DNA片段的粗略大小 （核苷酸對）
3、電場強度和電場方向：
低電壓時，線狀DNA片段的電泳遷移率與所加的電壓成正比，通常凝膠電泳的電場強度不超過5V/cm凝膠。隨電場強度增加，高分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增加，使凝膠的有效分離范圍縮小。對于大分子量真核基因組DNA片段的電泳常采用0.5~1.0V/cm電泳過夜，以取得較好的分辨力和整齊的帶型。如果電場呈周期性變化，各種分子量的DNA片段為適應新的電場變化所需的時間將不同，分子量越大，則所需的時間越多。因此可以通過脈沖電場凝膠電泳分離極大片段的DNA。
4、電泳環境
緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移率。Tris-Cl緩沖體系中，由于Cl－的泳動速度比樣品分子快得多，易引起帶型不均一現象，所以常采用含EDTA的Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）和Tris-磷酸（TPE）三種緩沖體系。傳統最常用的是TAE，但其緩沖能力很低，長時間電泳需要正、負電極貯液槽之間進行緩沖液循環，并經常更新TAE。TBE與TPE有較高的緩沖能力，現多用，但因TBE中硼酸易與瓊脂糖形成復合物，在短時間（≤5h）瓊脂糖凝膠電泳時，常用TAE，而在PAGE中常用TBE。雙鏈線狀DNA在TAE中遷移速率比TBE或TPE中快將近10%，但各個緩沖體系的分辨能力幾乎相同，（對超螺旋DNA，在TAE 中的分辨率比在TBE中的更好）。凝膠電泳后要回收DNA片段，不宜采用TPE緩沖體系，這使DNA片段含較高的磷酸鹽、易與DNA一起沉淀，而影響一些酶反應，緩沖液中含EDTA，目的在于螯合二價離子，抑制核酸酶以保護核酸。
緩沖液的離子強度與樣品泳動速度成反比，電泳的最適離子強度一般在0.02~0.2之間。在高速離子強度下（如誤加10×電泳緩沖液），溶液導電性極高并明顯產熱，可能引起凝膠熔解及DNA變性。
緩沖液的pH值影響DNA遷移率，溶液的pH值遠離樣品等電點時，樣品荷電量越多，泳動越快，核酸電泳液常用偏堿性或中性條件，使核酸帶負電荷，向正極泳動。
在進行電泳時，熒光染料EB可插入到堿基中，從而增加線狀和開環DNA的長度，使其剛性更強，并會使線狀DNA的遷移率降15%，另外溫度和堿基堆積也會影響DNA的遷移率。