植物染色體DNA的抽取及濃度測定

目的意義
DNA是遺傳信息的載體和基本遺傳物質，它在遺傳變異、代謝調控等方面起著重要作用，是分子生物學和基因工程研究的對象，但無論是研究植物DNA的結構和功能，還是開展外源DNA的轉化、轉導的研究，首先要做的就是從植物組織中提取天然狀態的高分子量的純化DNA。因此，本實驗的目的是學習植物基因組DNA提取方法、原理和DNA的鑒定技術。

Ⅰ 植物基因組DNA 的提取（CTAB法）
一、原理
植物組織中絕大部分是核DNA，它和組蛋白、非組蛋白結合在一起，以核蛋白（即染色質或染色體）的形式存在于細胞核內。CTAB(十六烷基三甲基溴化銨，hexadecyltrimethylammonium bromide，簡稱CTAB)：是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，當降低溶液鹽的濃度到一定程度(0.3mol/L NaCl)時從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白、多糖類物質分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。
在DNA提取過程中必須始終注意以下幾個關鍵問題：
（1）DNA的二級結構和雙鏈易受多種因素（如強酸、強堿、加熱、低鹽濃度、有機溶劑、酰胺類、尿素等）的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時避免使用變性的條件。
（2）抑制內外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜絕，現可以通過多種途徑來做到這一點：a、低溫操作；b、調節pH，使偏堿（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性劑；d、加螯合劑（EDTA）除去酶的鋪助因子（Mg2+），使酶活性喪失。
（3）防止化學降解。如過酸或過堿以及其它化學因素，會使DNA降解，一般綜合考慮，取pH8.0左右為宜。
（4）防止物理因素降解。如溫度太高或機械張力剪切等，DNA分子特別大，其分子量可達1012道爾頓，極易被機械張力拉斷，甚至在細管中稍急一些的流動也會使DNA斷裂，所以在抽提過程中要特別注意這一點，操作過程要盡量簡便、溫和、減少攪拌次數，也不要劇烈搖動。
（5）植物的次生代謝物（主要是胞質內的多酚類或色素類化合物）對核酸提取有干擾作用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料，這是因幼嫩的新生組織次生代謝物較少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鮮的。
分離提取植物DNA的方法很多，本實驗采用CTAB法提取DNA并通過紫外吸收法和電泳鑒定。

二、操作方法
（1） 取200mg樣品(在液氮中研磨成粉末狀)放入1.5mL離心管中，加入600μL DNA提取液，顛倒混勻5-6次。65℃保溫35分鐘以上，其間顛倒混勻一次。
（2）再加等體積的氯仿異戊醇(24：1)溶液輕輕搖晃30秒，在4℃下10000rpm/分鐘離心10分鐘后，取吸上清液(450μL)
（3） 再加兩倍體積的預冷異丙醇，混勻靜止10分鐘以上，在4℃下10000rpm/分鐘離心10分鐘后，棄上清。
（4） 用600μL70%乙醇洗滌沉淀，重復一次，在室溫下倒置晾干。
（5）沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至終濃度50μg/mL，在37℃下保溫半小時，將DNA樣品放入冰箱保存。

Ⅱ 植物DNA 純度的鑒定——紫外分光光度計法

一、原理
由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵，所以具有紫外光吸收性質。核酸在紫外光譜區有一條典型的吸收曲線，其吸收高峰在260nm處，吸收低谷在230nm處。蛋白質在紫外區的吸收高峰在280nm處，所以核酸的紫外吸收光譜數據是鑒定核酸的重要依據之一。但紫外法不能區分DNA和RNA，只能用來鑒定核酸的純度和含量。
純度鑒定時，需測定在230、260和280nm處的消光值，經驗數據表明，
純凈的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值過小，說明蛋白未脫凈；A260/A230過小，說明有雜質（一般為多酚類或色素）。
含量測定時，對于純凈的DNA來說，在實際應用中可根據260nm處的消光值O.D260值換算成含量，一般認為O.D260值為1時，相當于50μg/ml。在測定核酸粗制品時，樣品中殘留的蛋白質和色素等與其它具紫外吸收的雜質對測定有明顯干擾作用，大分子核酸制備過程中變性降解后有增色效應，因此有時此法測定的結果會高于定磷法。
二、實驗材料、儀器及試劑
1、材料 植物DNA
2、器材：紫外分光光度計、移液管、試管
3、試劑：TE溶液（pH8.0）（見前述）
三、操作方法
將純化的DNA溶液用TE（pH8.0）稀釋至每毫升含5-50μg DNA濃度范圍，用TE（pH8.0）作空白對照，于紫外分光光度計上測定260nm、280nm和230nm吸收值，計算A260/A230和A260/A280的比值，并換算出核酸的含量。

Ⅲ 植物DNA 分子量的測定——瓊脂糖凝膠電泳法
一、原理
以瓊脂糖凝膠為支持介質的電泳廣泛應用于核酸研究中，其操作簡單、快速，是分離、鑒定、純化DNA的標準方法。DNA分子在高于其等電點的pH溶液帶負電荷，在電場中向正極移動。DNA分子在電場中通過凝膠介質而泳動，除電荷效應外，還有凝膠介質的分子篩效應，也就是說與分子大小構象有關。實驗表明DNA遷移率與其分子量的對數成反比。因此通過參比已知標準分子量的DNA遷移率，可測定樣品DNA的分子量。用低濃度的熒光物質，插入性染料溴化乙錠（EB）使凝膠中DNA區帶染色，在紫外光下可直接顯示DNA在凝膠中的位置，靈敏度很高，可檢出10ng（10-9g）或更少的DNA含量。
二、實驗材料、儀器及試劑
1、材料： 植物DNA
2、器材：水平板型電泳槽裝置 電泳儀 254nm波長的紫外分析儀塑料手套 移液管 水浴鍋
3、試劑：
（1）T ris-HAc(TAE)緩沖液
A．濃縮的貯備液（50倍）每升含：242gTris 57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。
B．使用濃度：0.04mol/L Tris-HAc/0.04mol/L EDTA。
（2） 瓊脂糖：電泳純以上。
（3）溴酚藍甘油溶液（0.05%溴酚藍-50%甘油溶液）：先配制0.1%溴酚藍水溶液，然后取1份0.1%溴酚藍溶液與等體積的甘油混合即成。
（4）已知分子量的標準DNA（λDNA-ECORI/Hind III）。
（5） 10mg/mL溴化乙錠水溶液（EB）或GV水溶液。

三、操作方法
1．瓊脂糖凝膠板的制備
稱取0.7g瓊脂糖置于三角瓶中，加入100mlTAE緩沖液，在沸水浴中加熱至瓊脂糖完全溶解，冷卻至50℃，然后加入EB溶液使終濃度為0.5μg/ml。倒入凹形有機玻璃槽（事先用膠帶封住有機物玻璃板的邊緣）。使其成2mm左右的凝膠板。在其未凝固前將樣品槽模板（梳子）插入凝膠的一端，注意梳齒底與凝膠底之間應至少保持0.5-1.0mm的凝膠。待全部凝固后（室溫，約30-45分鐘），取出梳子及除去膠帶，將凝膠板與玻璃板一起放入電泳槽內，加入TAE緩沖液使剛好超過凝膠面約1mm。
2．加樣：將樣品與溴酚藍按4：1的比例混合，用移液器緩慢加入凝膠樣品孔中，點樣量為每孔5μgDNA。
3．電泳：點樣端接負極，電泳開始時，可用較高的電壓，如100伏特，這樣可使樣品很快進入膠內，而減少樣品擴散，待樣品進入膠內即可保持每厘米
5伏特左右的電壓，DNA在電泳中向正極移動。當溴酚藍的區帶移至距凝膠底部1-2cm，停止電泳，當膠板為10-15cm的長度時，電泳時間一般為2小時左右。
(4)觀察與鑒定
電泳結束后，取出凝膠板，在波長為254nm的凝膠成像系統下，觀察電泳圖譜，如果電泳條帶清晰(如果EB染色看到桔黃色熒光條帶，GV染色則看到綠色熒光條帶)，將凝膠照相。根據標準DNA的電泳圖譜，可以得知樣品DNA的分子大小。