植物蛋白質組學和糖基化實驗（二）

刀豆球蛋白 A (ConA)- 過氧化物酶方法（根據參考文獻 20 修改的方法)。

( 1 ) 通過 1D 或 2D 電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上。

( 2 ) 用 TTBS 緩沖液浸泡印跡膜 1 h。

( 3 ) 將印跡膜在含有 ConA ( 25 μg/ml）的 TTBS 緩沖液中，室溫下溫育 2 h。

( 4 ) 在 TTBS 緩沖液中漂洗 4 次，每次 15 min。

( 5 ) 將膜放置在含辣根過氧化物酶（HRP，50 μg/mL) 的 TTBS 緩沖液中，室溫下溫育 1 h。

( 6 ) 在 TTBS 緩沖液中漂洗印跡膜 4 次（每次 15 min)，顯影前在 TBS 溶液中漂洗一次。

( 7 ) 過氧化物酶的顯影作用與凝集素-生物素/鏈霉親和素-辣根過氧化物酶方法中的相同。

( 8 ) 實驗必須設對照，見注釋 4。

2 ) 特異性抗體的免疫檢測方法

我們已經報道了植物 N-復合糖苷的 β-1-2 木糖和 α-1-3-巖藻糖抗原表位在兔子血清中具有高免疫 [21] 。因此，含復合糖苷的糖蛋白抗血清往往含有抗 β-1-2 戊醛糖和 α-1-3 海藻糖的抗體。一些商業免疫血清與我們自制的探針具有相同的特性。如抗 HRP 的免疫血清可用作植物含有 α-1-3 巖藻糖和 β-1-2 木糖殘基的復合 N-糖苷的特異性探針。從蜂毒蛋白中獲得的免疫血清具有更強的特異性，可用作含 α-1-3 巖藻糖的植物復合糖苷的特異性探針[ 21] 。我們在實驗室，從兔血清中獲得了對復合型糖苷末端天線（三糖 Lewisa ) 的特異性兔抗體 [22] 。抗 Lewis  a 的單克隆抗體已商業化，但其非常昂貴。

阿拉伯半乳糖蛋白（AGP ) 和伸展蛋白可用商業單克隆抗體檢測（http://W W W . plantprobes.co.uk/) 。我們實驗室沒有使用過這些抗體，請參考描述這些抗體特異性的原始論文（見注釋 5) 。

( 1 ) 通過 1D 或 2D 電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上。

( 2 ) 用 含 3% 明膠的 TBS 緩沖液，室溫下浸泡印跡膜 1 h。

( 3 ) 用 含 1% 明膠和適宜稀釋濃度的免疫血清的 TBS 緩沖液，室溫下浸泡印跡膜 2 h。我們使用的 25. 2.2 節 1.2 ) 中提到的商業免疫血清，稀釋方法如下：

a. 兔抗 HRP 免疫血清，1 : 300。

b. 兔抗蜂毒蛋白免疫血清，1 : 200。

c. 鼠抗 Lewis 單克隆抗體，1 : 100。

( 4 ) 在 TTBS 緩沖液中漂洗 4 次，每次 15 min。

( 5 ) 用 含 1% 明膠和適當的標記抗體的 TBS 緩沖液，室溫下浸泡印跡膜 1 h。標記抗體可為 1 : 2000 稀釋的 HRP 標記羊抗兔 IgG (G 型免疫球蛋白）抗體，或 1 : 500 稀釋的 HRP 標記羊抗鼠多價免疫球蛋白抗體。

( 6 ) 在 TTBS 緩沖液中漂洗印跡膜 4 次（每次 15 min) ，顯影前在 TBS 溶液中漂洗—次。

( 7 ) 過氧化物酶的顯影作用與凝集素-生物素/辣根過氧化物酶方法中的相同（ 見 25.3.2 節 1.1)。

( 8 ) 對照見注釋 6 和注釋 7。

2. 糖苷單糖組分的分析

糖苷單糖組分的分析是通過用甲醇-HCl 溶液水解糖蛋白，然后用氣相色譜鑒定和分析單糖產物及其衍生物。單糖組分分析結果提供了連接到糖蛋白和/或 N-連寡聚糖）上的糖苷類型的初步數據。

( 1 ) 將 1 mg 純化的蛋白質樣品放入帶聚四氟乙烯涂層的螺旋蓋子的玻璃管中，進行凍干處理（見注釋 8) 。

( 2 ) 向待測蛋白質樣品中加入 5~10 μl 的 2 mmol/L 肌醇貯藏液（見注釋 9) 。甲醇分解反應之前再次凍干處理樣品。

( 3 ) 在蛋白樣品中加入 500 μl 濃度為 1 mol/L 甲醇-HCl 溶液，旋緊蓋子，置于 80°C 加熱過夜。

( 4 ) 甲醇分解反應后的樣品在氮氣保護下，40°C 加熱干燥處理樣品。注意：因甲醇有毒，應在通風櫥中操作。

( 5 ) 用 250 μl 甲醇漂洗，如步驟（4 ) 的操作，在氮氣環境下干燥處理樣品，重復漂洗步驟兩次。

( 6 ) 用 250 μl 甲醇重懸樣品，接著加入 25 μl 的乙酸，25 μl 吡啶，勻漿，在室溫下放置 6 h，如步驟（4 ) 的操作，在氮氣環境下干燥處理樣品。

( 7 ) 加入 250 μl 的硅烷化試劑，80°C 溫育 20 min ( 見注釋1) ，空氣吹干樣品。

( 8 ) 用 1 ml 環己烷沖洗，空氣吹干，并重懸于 200 μl 環己烷中，勻漿，離心，將 100 μl 衍生物樣品轉移到帶蓋的反應小瓶中。

( 9 ) 設置氣相色譜儀的氦氣壓強設為 1.4 bar，注入樣品前要將注射器和 FID 檢測器分別加熱到 250°C 和 280°C 。設置氦氣的壓力為 20 psi，流速為 3 ml/min。在注入 5 μl 的衍生物樣品（相當于 25 μg 蛋白質）之前，平衡色譜柱的溫度到 120°C。溫度梯度洗脫單糖衍生物：① 每分鐘升高 10~160°C。② 每分鐘升高 1.5~235°C。③ 235°C 4 min。 ④ 每分鐘升高 20~280°C。⑤ 280°C  3 min。