正常人關節軟骨細胞的長期培養

實驗材料：
1.    軟骨細胞來源：20—24周自然流產胎兒的股骨和脛骨；
2.    清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；
3.    消化液Ⅰ：2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml膠原酶混合消化液，用PBS液配制；
4.    消化液Ⅱ：0.5mg/ml膠原酶，用培養液Ⅰ配制；
5.    培養液Ⅰ：DMEM培養液，補充10%胎牛血清；
6.    培養液Ⅱ：DMEM培養液中補加10%胎牛血清、青霉素1000IU/ml、鏈霉素1mg/ml、兩性霉素2.5μg/ml、谷氨酰胺2mmol/L、1%維生素添加劑（vitamin supplements）以及維生素C 50μg/ml；
7.    10% poly HEMA：稱取6g多聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯（2-hydroxyethylmethacrylate，poly HEMA），加到50ml 95%乙醇中，于37℃恒溫振蕩水浴箱中緩慢振蕩過夜，次日將所得溶液離心（2500r/min，10min），除去未溶解的顆粒，此為干液。取1ml干液與9ml 95%乙醇混合，稀釋成10%（V/V）的poly HEMA溶液；
8.    篩網：孔徑為100μm的尼龍篩網；
 
實驗方法：
1.    在無菌條件下，從20—24周自然流產胎兒的股骨頭和脛骨坪切取骺軟骨。用PBS液洗凈血液。盡量除去纖維性組織；
2.    將軟骨放入消化液Ⅰ中，于37℃孵育1h；
3.    棄孵育液。將軟骨塊充分切碎，加入消化液Ⅱ，在37℃孵育過夜；
4.    用尼龍篩網過濾，濾液中加入培養液Ⅰ。再經250g離心5min，棄上清液；
5.    用培養液Ⅰ將細胞團吹散，重新懸浮細胞，離心。重復4次。用培養液將最后得到的細胞團制成懸液；
6.    計數細胞。從每克軟骨平均可獲得大約3.0×108個軟骨細胞；
7.    取0.9ml 10% poly HEMA溶液鋪在直徑為60mm的塑料培養皿內，水平放置在通風的超凈工作臺上干燥（過夜）；
8.    使用前將包被poly HEMA的培養皿用滅菌紫外燈照射30min；
9.    將含5×106個軟骨細胞的懸液接種到已包被poly HEMA的培養皿中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養；
10.每3—4d換一次液。培養可持續半年以上