江南大學長江學者發表CRISPR成果

　　枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC 6051a是用于酶工業生產的一種野生菌株。因為它的轉化效率較低，因此對這一菌株的遺傳操作，需要一種高度有效的基因組編輯方法。6月16日Nature子刊《Scientific Reports》在線發表了江南大學食品科學與技術國家重點實驗室的一項研究成果，題為“Multigene disruption in undomesticated Bacillus subtilis ATCC 6051a using the CRISPR/Cas9 system”。在這項研究中，研究人員構建了一種釀膿鏈球菌CRISPR/Cas9系統，由一個一體化的敲除質粒組成，其包含一個靶向特異性的引導RNA、cas9和一個同源修復模板，可用于枯草芽孢桿菌ATCC 6051a的高效基因敲除。

　　本研究通訊作者是江南大學研究生院副院長、教授、博士生導師吳敬，吳敬教授系中國藥科大學微生物與生化藥學博士，美國密歇根大學生化與分子生物學博士后，結構生物學助理研究員。主要從事酶制劑相關領域的教學和科研工作。近年來主持863課題、國家自然科學基金以及江蘇省工業支撐等多項國家省部級項目，在相關領域主流刊物上發表SCI論文70多篇。去年吳敬教授入選教育部2015年度長江學者特聘教授。相關閱讀：最新長江學者特聘教授公示名單（生物類）。

　　枯草芽孢桿菌是一種良好表征的革蘭氏陽性細菌，被廣泛用于不同蛋白質的生產。這個物種及其一些近緣種，有著良好的蛋白質分泌能力，被普遍認為是安全的，從而使它們成為抗生素、藥用蛋白質和工業酶生產的重要宿主。枯草芽孢桿菌168是攜帶許多突變的一種實驗室模式菌株，轉化能力得以改善。苦草芽孢桿菌菌株通常被用作重組蛋白的生產，如WB600和WB800，是在苦草芽孢桿菌168的基礎上被構建的。

　　由于枯草芽孢桿菌ATCC 6051a的重組蛋白生產能力超過； 枯草芽孢桿菌168，因此它已被廣泛用來生產工業酶。然而，枯草芽孢桿菌ATCC 6051a有一些野生的特性，阻礙了重組蛋白的胞外生產。尤其是，它能在發酵過程中會產生大量的泡沫、高度耐藥性的孢子、多種類型的胞外蛋白酶和高水平的淀粉酶。

　　為了改善這種重要菌株的有用性，研究人員試圖通過滅活5個基因，來修改這些特性。相比較實驗室菌株，枯草芽孢桿菌ATCC 6051a轉化效率低下，因為它包含一個84kb的內生質粒pBS32，其編碼一個單程的轉膜蛋白ComI——可抑制DNA吸收的能力。由于其能力較差，枯草芽孢桿菌ATCC 6051a的遺傳操作很難，并且需要一種高效的基因編輯方法。最近，有研究人員確定了枯草芽孢桿菌ATCC 6051a的基因組序列，這便于我們對其進行遺傳操作。

　　CRISPR/Cas系統近年來成為熱門技術，一些CRISPR/Cas系統需要多個蛋白質，而II型CRISPR/Cas系統需要一個核酸酶Cas9。在廣泛使用的釀膿鏈球菌II型CRISPR/Cas系統中，在crRNA中一段20bp的互補區域（N20），可引導Cas9核酸酶到達其特異性靶點，一段大約20nt的序列，稱為protospacer，在其3’端包含一段特定的protospacer-adjacent motif (PAM)。PAM序列帶領cas9在protospacer序列產生雙鏈斷裂，它是通過同源重組修復的。

　　最近，有研究人員開發出了包含crRNA和tracrRNA特征的嵌合的引導RNA（sgRNA），可簡化基因組編輯設計。作為一種高效的基因組編輯技術，II型CRISPR/Cas9系統已被證明在點突變、單基因缺失/插入和大型基因簇刪除方面，是切實可行的。直到最近，它已被廣泛應用于各種生物，包括但不限于大腸桿菌、肺炎鏈球菌、釀酒酵母、羅伊氏乳桿菌、家蠶、果蠅、小鼠和人類細胞系。

　　盡管已有幾項研究在微生物系統中成功實施了CRISPR/Cas9系統，但是在枯草芽孢桿菌中利用CRISPR/Cas9系統進行基因組編輯，還沒有相關報道。這項研究在枯草芽孢桿菌ATCC 6051a中建立和優化了CRISPR/Cas9系統。該研究小組使用這一系統，破壞了枯草芽孢桿菌ATCC 6051a中的五個基因（srfC, spoIIAC, nprE, aprE和amyE），這些基因阻礙了它在工業發酵過程中的用途。與枯草芽孢桿菌ATCC 6051a相比，這一突變株——稱為BS5，可在控制水平上產生更少的泡沫，對孢子形成表現出極大的抵抗性，并向發酵培養基中分泌了2.5倍多的β-環糊精糖基轉移酶（β-CGTase）。β-CGTase被廣泛用于β-環糊精的生產，并主要用野生菌株和大腸桿菌生產，這分別存在低分泌性和食品安全的問題。從枯草芽孢桿菌分泌的β-CGTase增加，可以在很大程度上降低β環糊精生產的成本，這顯示出了BS5極高的工業價值。

　　本月還有幾項關于CRISPR的研究成果，例如，6月1日，哈佛醫學院著名的遺傳學教授George Church以通訊作者身份，在國際著名期刊《The FEBS Journal》發表題為“Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators”的綜述文章，暢談CRISPR這項革命性技術的下一站：RNA引導的表觀遺傳學調節因子。相關閱讀：遺傳學大牛談CRISPR革命的下一站。

　　來自華中農業大學、中科院武漢病毒研究所、巴基斯坦醫學科學研究所以及華中科技大學同濟醫學院的研究人員，在國際著名學術期刊《Oncotarget》發表題為“CRISPR/Cas9 therapeutics: a cure for cancer and other genetic diseases”的綜述文章。相關閱讀：華中農大CRISPR療法綜述刊登國際期刊。

　　6月10日，國際著名學術期刊《Journal of Biological Chemistry》在線刊登了廣州醫科大學第三附屬醫院孫筱放教授帶領的一項研究成果，該研究小組將ssODNs與CRISPR/Cas9介導的基因組編輯相結合，來特異性地靶定HBB基因CD41/42 (-CTTT)突變。相關閱讀：廣州醫科大學用CRISPR糾正地貧突變。