法醫DNA檢測儀器及其發展動向分析

摘    要：

實踐證明,法醫DNA檢測技術和相關儀器在犯罪嫌疑人認定、親權鑒定和系列串并案偵破中發揮了顯著作用,是我國公安一線偵察破案和打擊犯罪的重要技術手段。以法醫DNA檢測技術為主線,對相關儀器的產生背景、發展歷程、工作原理、各類技術優劣,以及國內外研究現狀進行了綜述,最后對國內該領域技術發展方向和相關政策等提出了系列建議。

關鍵詞：

法醫; DNA檢測; STR; 遺傳分析儀; 片段分析;

隨著科技的發展,法醫DNA檢測技術在公安一線已成為個體識別、打擊犯罪不可或缺的科學利器。三十多年來,法醫DNA檢測技術經歷了多位點DNA指紋圖分析技術、擴增片段長度多態性分析技術(AMPFLP)、線粒體DNA(mt DNA)檢測技術三大技術革命。目前已發展到以熒光標記多基因座STR復合擴增檢測技術、線粒體DNA (mt DNA)檢測技術和SNP分析技術為主導的技術體系。 其中,針對DNA片段長度多態性檢驗的STR技術是當前國內外DNA檢驗領域采用的主要手段。此外,線粒體DNA因具有高度序列多態性也可用于個體識別、親緣鑒定,并且對于陳舊、腐敗或只含角化細胞的檢材分析上具有核基因組DNA沒有的優點,在法醫學中有不可替代的應用價值, 日益成為實驗室的常規檢測方法;SNP分析也具有個體識別和親權鑒定的能力,累積識別率可以達到與DNA多基因座指紋圖同樣水平,雖然目前尚未形成成熟的SNP位點檢測體系,但該技術的諸多優點使其有望成為未來的常規法醫DNA檢測技術。以上這些技術的實現離不開相應的檢測平臺,法醫DNA檢測儀器的發展決定了各種法醫DNA檢測技術的實用性能和發展速度。因此,該類儀器逐漸成為法庭科學領域和分析儀器領域的研究熱點。

一、 儀器平臺發展歷程

作為法醫DNA檢測不可或缺的平臺和工具,主流的法醫DNA檢測儀器大致經歷了兩個階段的發展。第一代DNA檢測設備產生于上世紀80年代,其核心技術為平板凝膠電泳,電泳通路由包含許多小孔的固態介質(瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠)和緩沖液組成,DNA分子在凝膠中完成電泳過程,電泳分離后,采用UV光源和照相機對已染色的DNA分子進行熒光激發和拍照分析[1]。早期的多位點DNA指紋圖和AMPFLP、STR等位基因等均采用平板凝膠電泳進行檢測,由于檢測效率低,需要大量的技術人員參與。第二代DNA檢測儀器以集成化、自動化為基礎,開始于上個世紀90年代,為大規模的基因測序奠定了基礎。 1995年,美國AB公司推出了377型平板式遺傳分析儀(通常將具有DNA測序功能的儀器稱為DNA測序儀,而將可以檢測和分析DNA片段長度多態性的DNA測序儀稱為遺傳分析儀),采用薄層聚丙烯酰胺凝膠分離DNA分子,使用Sanger末端終止法、四色熒光標記,通過讀取這四種熒光信號獲得待測樣品的序列。該儀器采用的平板電泳鋪膠麻煩,因此迅速被采用毛細管電泳技術的平臺取代,此測序技術的產生和發展源于生物技術中的雙脫氧終止法和PCR反應,目前已經成為應用最廣泛、技術最成熟的主流技術。此后雖然出現了一些新的技術與方法,如2005年初美國貝勒醫學院和萊斯大學的研究人員研制出的“色盲” 熒光檢測方法、2005年美國454 Life Sciences公司研究人員發明的微流控芯片技術等,在某些方面也取得了令人滿意的效果,但都存在著不同程度的缺陷,短期內在常規的法醫DNA檢測設備中難以進行大規模的應用和推廣。

我國法醫DNA分析技術起步較早,早在1985年國際上首次報道DNA指紋技術應用于法醫鑒定以來,我國法庭科學工作者就開始了這方面的研究工作,但僅僅局限于一些試劑、引物以及分析方法的研究,在儀器設備方面則一直依靠進口國外產品來滿足需求,形成了對國外產品的高度依賴。 針對上述情況,國內一些科研院所曾經開展過DNA檢測平臺硬件方面的研究探索工作,但都是針對法醫DNA專用檢測平臺硬件的某個局部,雖具有一定的實用價值,但無法形成完整的技術體系。直至“十一五”前期,國內尚無法醫DNA檢測平臺硬件生產廠家,在這方面的技術自主性相對較弱,尤其在主流技術、核心技術的掌握上極其匱乏,基本處于被動接受、被動更新的境地。為此,“十一五”期間我國在相關領域加大了科研投入,國內多家公司和研究所先后取得了突破性的成果:深圳華因康基因科技有限公司研制成功了Pstar-II系列高通量基因測序儀[2];中科院北京基因組研究所與中科院半導體研究所研制成功了基于第二代測序技術的模塊化DNA分析系統[3];中科院北京基因組研究所與浪潮集團共同啟動了基于第三代測序技術的DNA測序儀研制[4], 公安部第一研究所成功研制了法醫DNA專用檢測遺傳分析儀。這些國產DNA檢測平臺正在逐步建立并走向成熟,在不久的將來可擺脫相關領域受制于人的困境。

二、 主流儀器平臺組成及工作原理

如前所述,熒光標記多基因座STR復合擴增檢測技術自上世紀90年代誕生以來,由于STR等位基因具有諸多適宜于法醫DNA檢驗的特點,一直是法醫DNA檢測的主流技術。STR等位基因的檢驗依據是DNA片段的長度多態性, 用于DNA片段分析技術的檢測手段主要有三種:激光誘導熒光檢測技術、微流控芯片技術和飛行時間質譜技術。基于激光誘導熒光檢測的自動化遺傳分析儀應用最早,技術最為成熟,是目前唯一實現商業化生產、全面配套和大規模應用的儀器,但是該技術的儀器設備體積較大、配套消耗品成本較高。微流控芯片技術具有微型化、快速(檢測速度是常規技術的10~100倍)、靈敏度高、樣品消耗量小、重復性好等特點,可以實現DNA檢驗設備的小型化、 便攜化[5,6],但是該技術在法醫DNA檢測上的應用目前還不成熟,一些技術難點還沒有攻克。飛行時間質譜技術具有快速(單個樣品檢驗時間5分鐘)、抗干擾、不需要復雜的試劑配套、樣品消耗量小等特點[7],但該技術同樣存在儀器設備體積較大以及技術不成熟等問題。

綜上,激光誘導熒光檢測技術目前仍是國際上應用最廣泛、技術最成熟的主流技術。國內外用于法醫DNA檢測的儀器平臺均基于該技術,該類型的遺傳分析儀產生于上世紀80年代,目前已經過多次技術更新,主要體現在分離系統和光電檢測系統兩個方面。分離系統經歷了兩代技術發展,第一代的核心技術為垂直板電泳技術,其光電檢測系統以光電倍增管(PMT)為核心;第二代的核心技術為毛細管電泳技術,其光電檢測系統以電荷耦合器件(CCD)為核心。目前商業化儀器大多采用毛細管電泳技術作為分離系統,采用PMT或CCD作為光電檢測系統,這種儀器平臺的主要工作原理如圖1所示,用“電動進樣” 的方法將帶負電荷的待檢DNA片段分子遷移到注滿凝膠的毛細管進樣端(負極),然后在毛細管兩端加上直流電壓,被熒光標記的DNA片段在一定的溫度和電壓條件下在毛細管內進行電泳,樣品中不同大小的DNA片段開始從負極向正極方向移動,由于受到具有分子篩效應的凝膠的阻滯,據其分子量大小而具有不同的遷移率,片段越短,移動得越快,電泳的結果使長度不同的DNA片段互相分離, 并且按片段的長短順序通過檢測窗口。當標記有熒光素的DNA片段移動到檢測窗口時,激光束在檢測窗口處對標記在DNA片段上的熒光素進行激發,熒光素受到激發而發出特定波長的熒光,此熒光信號被光電檢測系統(CCD檢測器)所采集并被轉化為電信號,經數據處理后存儲到計算機進行下一步的分析處理[8]。

為了確定DNA片段的長度,與樣品一同電泳的還有分子量內標,分子量內標是已知分子量的DNA片段,其上附有特定熒光波長的熒光素。計算機根據熒光信號的出現時間,與特定熒光波長的分子量內標信號出現時間進行比對,確定待測DNA片段的分子量大小(即片段長度)。再通過熒光的波長范圍來定位該DNA片段所在的STR基因座(其對應關系由STR復合擴增試劑盒決定),從而獲得被檢STR基因座的基因型。依此方法分析試劑盒中多個STR基因座的檢測結果,即可確定被檢DNA樣品來源的個體基因型,實現個體識別。

根據熒光標記多基因座STR復合擴增檢測體系的要求,一個完善的基于“毛細管電泳激光誘導熒光檢測技術”的遺傳分析儀應具備下列性能:

(1)電泳電源具有高穩定度的恒壓性能,以確保電泳過程中DNA片段遷移率恒定;

(2)實現具有排氣泡功能的毛細管高壓凝膠注入, 滿足毛細管自動注膠的要求;

(3)具有較高的電泳溫度控制精度:STR等位基因的電泳檢測溫度要求在60℃±0.1℃,以確保作為篩分介質的凝膠工作在最佳溫度,獲得DNA片段的最佳電泳遷移率, 確保多個毛細管電泳通道的檢測結果具有可比性,確保多次DNA檢測的結果具有良好的重現性;

(4)配備高靈敏低噪音的光電檢測器,以采集微弱的熒光信號,從根本上確保樣品具有極高的檢出率;

(5)能進行精確的進樣控制,以確保多通道樣品進樣和多次檢測結果的一致性,確保毛細管準確定位在樣品池、緩沖液池、清洗池、廢液池中,實現進樣、電泳過程的全自動化。

要實現以上性能,遺傳分析儀中除包含有毛細管電泳通路外,其組成還包括高穩定度的高壓電泳電源、全自動注膠系統、三維進樣機構、高精度恒溫箱、激光誘導毛細管內熒光激發系統、毛細管內熒光高靈敏度檢測系統以及實現全自動控制的嵌入式測控系統、外部計算機工作站的數據預處理及分析系統。上述各功能模塊有機結合,依照不同的法醫DNA檢測流程,在整機測控程序的驅動下,實現了DNA遺傳信息的有效檢測和分析。

三、 國外儀器的最新發展

毛細管電泳的主要缺點是檢測通量相對較小,因為每個樣本必須依次進行分析,單根毛細管的電泳裝置不適用于大量樣本的分析。為此,國外公司先后研發了各種通道的遺傳分析儀,這些儀器在通道數增加的同時,在注膠系統、恒溫系統、光學系統、進樣機構等部件及配套軟件上進行了更加精細的改進,提高了儀器的檢測性能。

上述遺傳分析儀的另一功能是測序,可以實現其它法醫DNA檢測功能,包括mt DNA序列檢測和SNP多態性檢測。這些儀器的測序原理均基于Sanger發明的末端終止測序法,該方法因為既簡便又快速,并經過后續的不斷改良,成為了迄今為止DNA測序的主流。然而隨著科學的發展,傳統的Sanger測序已經不能完全滿足研究的需要,對模式生物進行基因組重測序以及對一些非模式生物的基因組測序,都需要費用更低、通量更高、速度更快的測序技術,第二代測序技術應運而生。第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序,即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列,現有的技術平臺主要包括Roche/454FLX、 Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。這三個技術平臺各有優點, 454 FLX的測序片段比較長,高質量的讀長能達到400bp; Solexa測序性價比最高,不僅機器的售價比其他兩種低, 而且運行成本也低,在數據量相同的情況下,成本只有454測序的1/10;SOLID測序的準確度高,原始堿基數據的準確度大于99.94%,而在15X覆蓋率時的準確度可以達到99.999%,是目前第二代測序技術中準確度最高的[9]。

第二代測序技術雖然在各方面都有了較大的突破,但是仍然建立在PCR擴增的基礎上。為了避免PCR擴增帶來的偏差,實現更快的檢測速度,科學家目前正在研制對DNA單個分子直接測序的第三代測序儀。最具代表性的包括Heliscope單分子測序儀,SMRT單分子實時合成測序法,Ion torrent半導體測序技術,Oxford納米孔測序技術等。Helicos Biosciences公司的Heliscope技術仍然是基于合成測序原理[10],采用極高靈敏度的熒光檢測儀識別測序時的熒光信號,能夠直接記錄到單個堿基的熒光,從而克服了其他方法須同時測數千個相同基因片段以增加信號亮度的缺陷。Pacific Biosciences公司研發的單分子實時合成測序法(SMRT^TM),充分利用了DNA聚合酶的特性,可以形象的描述為通過顯微鏡實時觀測DNA聚合酶,并記錄DNA合成的整個過程。AB公司的Ion Torrent新一代測序儀則利用硅芯片檢測測序反應時氫離子的轉移,由于不需要熒光標記,有效降低了測序成本。Oxford Nanopore的納米孔測序技術也不需要熒光標記,使用核酸外切酶消化單鏈DNA分子,逐一剪切下單個堿基,利用不同堿基在通過納米小孔時引起的靜電感應稍有不同[11,12],或者不同堿基通過小孔的能力各有差異,來加以區分不同的堿基信號[13]。 新一代測序技術的應用領域相當廣泛,除了在科研領域, 在臨床醫學及食品安全領域也有著廣泛的應用前景。

第二代測序儀和第三代測序儀雖然大幅提高了檢測通量,但由于其讀長較短,后期數據拼接繁瑣,對具有重復序列的STR等位基因難以進行檢測分析。且第二代測序儀的一次樣品制備及檢測時間以星期為單位,難以滿足法醫DNA檢測的快速要求。因此,采用新一代測序技術進行STR基因分型在未來很長一段時期內仍無法實現,但其測序功能可作為法醫DNA檢測的輔助手段,用于mt DNA序列和SNP位點等多態性檢測。

值得關注的是,近年來,以微流控芯片代替毛細管陣列的遺傳分析儀取得了長足的發展,Rapid HIT 200 DNA快速檢測儀、P-DNA Analyzer已正式推出,這些儀器集成了DNA提取等樣品前處理流程,體積小,使用簡單,適用于現場檢測;但其樣品要求相對嚴格,檢測成本相對較高, 限制了其大范圍應用。

四、 國內儀器的發展展望

由于法醫DNA檢測儀器涉及領域多、技術難度大、系統集成度高、儀器與消耗品和試劑的聯系緊密,因此開發和生產的難度很大,此前國內尚無與法醫DNA檢測技術相配套的儀器、試劑和消耗品一體化的專業生產廠家。為改變上述狀況,公安部所屬的部分科研單位,近年來對法醫DNA的檢測技術逐步開展了深入的研究,已經取得了顯著的成果,形成了法醫DNA專用檢測儀器、試劑、配套軟件及耗材的國產化全面解決方案。

基于國內已有的儀器平臺基礎,根據我國各地DNA實驗室的應用需求,筆者認為國內法醫DNA檢測儀器還應主要向兩個方向發展:

(1)充分優化整合實驗室資源,設計建立一套適合我國國情、相對經濟、高通量的自動化DNA檢驗技術方案。按照DNA檢驗流程,實現被檢樣品在法醫DNA實驗室各種設備及檢測儀器間的自動流轉和處理,生成的DNA檢測數據自動集中存儲,確保檢測結果的可溯源性,形成一套具有統一操作規范、科學判斷標準、獨立知識產權的法醫DNA實驗室系統解決方案。

(2)建設同時具備設備、軟件、試劑和耗材研發能力的大型研究與科技成果轉化平臺,形成具有核心競爭力的產品體系。隨著新應用、新需求的不斷增加,我國在法醫DNA檢測技術領域的研發任務仍然艱巨,要形成有競爭力的國產儀器平臺,必須實現檢測方法、檢測儀器的一體化研發,并根據法醫DNA檢測技術的最新發展,加緊開發具有自主知識產權的下一代系列產品,提升國產儀器的核心技術價值。

目前,我國法醫DNA數據庫建設逐步完善,數據錄入量以每年近600萬的速度大幅增加,法醫DNA檢測技術在犯罪嫌疑犯認定、親權鑒定和系列串并案中的作用越來越顯著,公安一線對法醫DNA檢測儀器的需求日趨強烈。可見,我國的法醫DNA檢測儀器具有廣闊的應用和發展空間。