活體多光譜熒光成像應用實例（一）

傳統的活體光學熒光成像（FLI）采用一個激發濾光片和一個發射濾光片。這對于區分靶向信號、可能存在的報告基因信號以及自體熒光組織信號而言有著諸多局限。多光譜（MS）FLI 采用多個激發濾光片和單個發射濾光片，或單個激發濾光片搭配多個發射濾光片，可以產生獨特的熒光區域或材料的光譜曲線。（1）因此，圖像上每一個像素點的熒光組分可以由此來確認（圖 1）。

選擇活體MS FLI 有兩大原因：

1-在組織自體熒光的特定范圍內對波長較短的報告基因進行成像時，可以抑制自體熒光背景信號。

2-在利用帶有重疊譜的波長較長的報告基因（如 NIR）進行成像

時，可以抑制交叉反應對獨特的報告基因實現清晰的檢測。

為了了解這兩大原因，首先有必要了解小鼠組織自體熒光的基礎知識，及其在熒光光譜不同范圍中的成像。下圖 2 顯示了在采用綠/紅、藍/綠濾光片和 NIR 濾光片組合（2）時小鼠組織典型的天然自體熒光特性。值得注意的是綠/紅和藍/綠濾光片表現出較高的組織自體熒光水平，但 NIR 濾光片成像表現出的組織自體熒光相對較少。在使用綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（RFP）等報告基因、異硫氰酸熒光素（FITC）和 Alexa 600 時應用MSFLI可以有效地減少組織自體熒光。而遠紅（650-700 nm）或近紅外（NIR; 700-900 nm）熒光團作為替代方案，因為在此光譜范圍內皮膚自發熒光作用較小，但需要多重濾光片（3）。這種方法可以同時檢測多個分子標志物，例如 熒光細胞示蹤報告探針和 熒光 蛋白酶活力報告探針等。此外，鼠類食物經常包含含葉綠素的植物材料，可能在低 NIR 光譜中產生強烈的自體熒光。多光譜成像常常用于抑制這種胃腸道（GI）自體熒光，避免因成像研究而將飼料更換為無紫苜蓿的鼠類飼料。

布魯克系統采用“基于激發”的多光譜成像方式。其中，多個激發濾光片和單個發射濾光片被用來捕獲“疊合圖像”。對于包括基因熒光蛋白報告在內的大多數有機熒光團而言，激發光譜可以比發射光譜（圖 3）提供更多的信息，而與基于發射的多光譜成像相比，基于激發的多光譜成像能夠更好地捕獲這些不同的信息。

系統共配置 28 個激發濾光片。在定義發射濾光片前，應該為給定的成像實驗選擇最佳激發濾光片。而為了更好地選擇濾光片，事先比對用于成像的報告基因的激發光譜曲線的熒光光譜差異是非常有用的。在下方（圖 4）Alexa 680 和 Alexa 700 的例子中，二者在 520 和 720 nm 之間的激發光譜存在明顯差異。（了解 Alexa 680 和Alexa 700 濾光片選擇和建模的完整內容，請查看網絡研討會： https://youtu.be/iEyLl3qAzpA)。

系統配置 6 個發射濾光片（535 nm、600 nm、700 nm、750 nm、790 nm 和 830 nm）。通常選擇在波長最長的激發濾光片60 nm 內不重疊的發射濾光片。所選發射濾光片無需與熒光發射的峰值一致，濾光片應優先選擇覆蓋特異熒光光譜的激發濾光片。繼續以 Alexa 680 和 700 成像為例，由于 535、600、700 和 750 nm 濾光片帶寬范圍與選定的激發濾光片范圍（圖 5）重疊，因此這里可以選擇 790 nm 的濾光片。