活體大體積實時成像新方法

　　哺乳動物的長期亞細胞活體成像對研究天然生理過程中多種細胞間行為和細胞器功能至關重要。然而，光學異質性，組織不透明性和光毒性提出了巨大的挑戰。

　　2021年5月25日，清華大學戴瓊海，俞立及范靜濤共同通訊在Cell 在線發表題為”Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale“的研究論文，該研究提出了一種計算成像框架，稱為數字自適應光學掃描光場相互迭代層析成像（DAOSLIMIT），它具有高速，高分辨率3D成像，平鋪波前校正和緊湊型系統的低光毒性。

　　通過同時對整個體積進行層析成像，該研究獲得了在225×225×16μm3范圍內的體積成像，在數十萬個時間點上，毫秒級的橫向分辨率高達220 nm，軸向分辨率高達400 nm。為了建立功能，該研究探索了中性粒細胞遷移和腫瘤細胞循環過程中不同物種的大規模細胞遷移和神經活動，并觀察了哺乳動物的各種亞細胞動力學。

　　活體器官中的細胞構成了一個精妙的微觀世界，在該世界中，細胞和細胞器的可塑性，相互作用和遷移長期以高時空分辨率在多種生理現象中起著至關重要的作用。大量信號和組織成分的參與提供了一個自然的環境，以反映生物過程的自然動力學，這些生物學過程不僅難以在體外或離體重建，而且在觀察生物過程中也面臨著巨大挑戰：例如，心跳和呼吸會引入運動模糊和偽影，而不會產生很高的成像幀速率。組織中折射率的不均勻分布會導致嚴重的光學像差，從而降低圖像分辨率和信噪比。強光劑量會干擾正常的細胞行為和細胞器功能，導致體內成像的光子分別不均。

　　為了解決這些問題，在過去的十年中，為發展亞細胞活體顯微鏡（IVM）進行了各種努力，例如旋轉盤共聚焦顯微鏡（SDCM），自適應光學顯微鏡（AO），高速雙光子顯微鏡和光片顯微鏡（LSM），促進了動物的神經科學領域，發育生物學，免疫學和癌癥生物學的各種研究，但是，在分辨率，速度，SNR和樣品健康之間存在不可避免的權衡。在通常需要對多個平面進行軸向掃描的三維（3D）生物中，情況變得更糟。

　　文章模式圖（圖源自Cell ）

　　因此，一個實驗的時間窗口只能支持數百個體積，以避免總光劑量低于?300 J / cm2的光損傷。LSM通過僅激發對焦區域來避免不必要的曝光來緩解該問題。帶有AO的Lattice LSM（LLSM）進一步提高了透明生物體的時空分辨率，但是小視場（FOV）和平鋪AO校正都限制了其在大體積下的速度。此外，由于組織的不透明性和空間限制，很難在亞細胞分辨率下將LSM應用于哺乳動物組織。在哺乳動物中以亞細胞分辨率和低光子劑量進行長期，高速成像仍然是一個挑戰。

　　在各種形式的平行體積成像中，光場顯微鏡（LFM）通過同時對整個體積進行成像提供了最有效的光子解決方案。受益于高速3D成像和緊湊型系統，LFM在大規模神經記錄中取得了巨大成功。但是，即使使用高級算法和方案，其空間分辨率和角分辨率之間的內在折衷通常將其分辨率保持在1μm左右，這對于亞細胞結構來說還遠遠不夠，并且限制了細胞生物學的廣泛應用。

　　在這里，該研究提出了一個框架，稱為數字AO掃描LF互斥層析成像（DAOSLIMIT），通過利用超大規模時空分辨率和數十萬個時間點，以超高的時空分辨率和低光毒性實現像差校正的3D熒光成像。該研究開發了一種緊湊型掃描LFM（sLFM）系統，該系統具有圖像平面的周期性漂移，以接近衍射極限的分辨率和全光子效率收集四維（4D）空間角光分布。除了進行各種定量評估和比較外，該研究還展示了其在多種物種（包括果蠅幼蟲，斑馬魚和小鼠）中對細胞生物學和神經科學的效用。