流式細胞術在高等植物研究中的應用（二）

3.流式細胞術在高等植物中的應用

3．1應用于植物中的特殊性

由于植物細胞與動物細胞在結構上的差異，例如植物細胞具有細胞壁、特殊細胞器以及中央液泡等，因此流式細胞術應用于植物細胞時，在樣品制備、染色、儀器的改造等方面都應適應植物細胞的上述特點。

3．1．1制備植物染色體懸液的材料

1984年De Laat和Blass用纖細單冠菊(Happus gracilis)的懸液細胞第一次對植物染色體懸液進行流式計數分析，然而核型的不穩定性卻成為流式細胞術應用于計數的最大障礙。隨后ConiatS]等嘗試著從幼葉原生質中分離出染色體進行分析，但由于細胞同步化程度較低，這種方法沒有得到廣泛的應用。直到1992年Dolezelt9]~lJ用根尖分裂組織制備細胞懸液，由于大多數植物的根尖較易獲得且其核型較穩定，因此利用根尖材料制備染色體懸液成為廣泛使用的方法。

3．1．2細胞周期同步化和中期染色體富集

為了富集足量同步化的中期染色體，秋水仙堿常被用于抑制有絲分裂過程中紡綞絲的形成。但由于其對植物微管蛋白親和力較低，需要使用較高的濃度，對人體會造成高毒性的危害以及在植物遺傳上產生不穩定性。另外秋水仙堿也會導致染色體過于粘稠，不適用于染色體分揀等后續操作。1992年Dolezel等發現應用甲基氨草磷(APM’Apiprophos—methy1)、安磺靈(Oryzalin)、氟樂靈(Trifluralin)等人工除草劑代替秋水仙堿，在微摩級濃度時便可見顯著的抗微管作用。

3．1．3染色體懸液的制備

由于植物細胞存在細胞壁，對染色體的分離造成了一定困難，通常有兩種方法從同步化的細胞中釋放染色體。其一，利用果膠酶和纖維素酶酶解細胞壁，然后將所獲得的原生質體置于低滲緩沖液中，使得染色體得以釋放；其二，將同步化根尖細胞經甲醛固定后進行機械分離從而釋放染色體。相對而言，后者更加快速，并且避免了長時間的酶解，減輕了對染色體的傷害。

3．1．4儀器的改造

由于植物細胞原生質體較大且脆弱，所以應使用100—200 Ixm孔徑的噴嘴，還應降低鞘液的壓力以保證通過噴孔的層流條件，并能夠觀察到液滴的形成，同時降低液滴形成的信號頻率，以使直徑大的液流能準確的形成液滴。此外還需降低液滴偏轉系統，以便觀察液滴。

3．2在植物學研究中的應用

3．2．1細胞核分析

FCM 在細胞核分析方面的應用范圍涉及DNA、RNA、蛋白質含量的分析、染色質結構分析、細胞周期分析、倍性分析等方面，是FCM在植物中應用最廣泛、最基本的領域。Van’t Hof[ 0]用Hoechst33258熒光素對棉花(Gossypium hirsutum cv．MD5 1ne)纖維細胞進行染色后，以人類口腔上皮細胞的細胞核DNA含量作為標準對照，通過FCM 分析， 發現花期過后2 d的胚珠內DNA含量增加了24％。由于在細胞周期的各時相中，染色質的凝集程度不同，經酸或堿處理后，變性程度也不同，Rayburn等通過調整與DNA結合方式不同的兩種染料的比例，經FCM 分析后確定玉米(Zea mays)中異染色質的含量。通過流式細胞術對細胞周期變化情況進行分析，李濤等【 2]認為交變應力作用可直接影響煙草細胞或細胞分裂的同步化，促進S期的DNA合成，有助于細胞的有絲分裂。另外，Wan 等應用流式細胞術分別對經花粉培養和花藥培養所獲得的椰菜(Brassica oleracea)再生植株進行DNA含量分析，認為經花藥培養所得到的植株更易發生染色體倍性變異。通過對野豌豆染色體倍性差異的分析，Kathleen等【 4】應用FCM 與根尖染色體壓片法，對美國農業部國家種子保藏實驗室的45個標記為長柔毛野豌豆(V&ia villosa)的標本進行鑒定，發現其中的兩個標本應為褐毛野豌豆 pannonica)，充分說明流式細胞術在植物種質資源鑒定中快速而有效。由于FCM分析檢測速度快，工作周期短，獲得的信息量大，數據結果客觀準確，統計學精度高，并且不使用放射性污染物質，現已成為細胞動力學研究和細胞周期分析的主要手段。

3．2．2原生質體分析

FCM 在原生質體分析方面的應用主要測定原生質體大小、細胞壁生物合成、原生質體與微生物的相互作用、原生質體融合產物分選、被膜抗原的表達等。在植物細胞研究中主要應用于分選出活的原生質體，并通過分選出來的原生質體再生出植株，其中最有意義的就是選出由原生質體融合所產生的異核體。采用流式細胞術，對酸橙(Citrus aurantium L．)葉肉原生質體和甜橙(C sineniscv．Shamouti)胚性愈傷組織原生質體電融合后再生的體細胞雜種進行分析，結果表明，所有的體細胞雜種植株熒光強度是二倍體對照的兩倍，這說明兩者的原生質體已經融合。通過使用FCM 分析enod40轉染的擬南芥屬野生植物原生質體，Guzzo等發現導致前向角散射及細胞大小減少的基因有所表達，說明enod40對原生質體具有直接作用。用流式細胞術對熒光強度進行定量檢測，還可以用來定位植物激素結合位點的空間分布，Yamazaki等用生物素化脫落酸(bioABA)來定位蠶豆氣孔保衛細胞質膜的脫落酸感應位點，將位點用熒光素標記后，在保衛細胞原生質體表面可以觀測到熒光微粒斑點，通過成像系統成功定位脫落酸結合位點的空間分布情況。

3．3-3染色體分析

1975年，Gray等【 B]從中國倉鼠細胞中分離出染色體，用DNA熒光染料進行染色，根據染料含量的不同用流式細胞儀將單個染色體進行分揀，開創了流式細胞遺傳學。由于在染色體懸液的準備與單條染色體辨別方面存在著困難，利用流式細胞術分析與分選植物染色體一直未能取得預期的效果，但人們發現使用轉座系和缺失系可以將一些無法分離的染色體從復合峰中分離出來【 。1984年，De Laat和Blass~第一次報道了用流式細胞術識別和分揀植物染色體。隨后流式細胞術被證明是一個非常有用的工具，它能快速精確地檢測染色體數目和結構的畸變，以及非整倍體和染色體缺失。目前已在l7個物種中利用流式細胞術對染色體進行分析與分選，包括玉米(Zea may cv．Seneca 60)、小麥(Triticumaestivum L．)、大麥(Hordeum vulgare L．)、黑麥(Secalecereale)tar231等。另外，Macas等 在1993年利用FCM對碗~_(Viciafaba L． 流式核型進行分揀，結合PCR技術對其DNA進行物理定位， 成功實現了USP基因(unknown seed protein genes)、碗豆球蛋白基因(vicilin genes)和豆球蛋白毋基因(1egumin Bjgenes)、豆球蛋白 基因(1eguminB4 genes)、假基因(pseudogenes )在相應染色體區域上的定位。流式細胞術還可以分選出指定的染色體，用來建立染色體DNA 文庫，但目前在植物中僅有番茄(Lycopersicon pennellii)t~和蠶豆( 口L．) 染色體DNA文庫的報道。李立家等已將流式細胞術和PCR技術相結合，應用于類玉米中抗病基因類似物序列的研究。

4展望

從1930年Caspersson和Whorellt31以細胞的計數開始，試圖尋找研究細胞的新工具，到1973年BD公司與美國斯坦福大學合作，研制開發并生產了世界上第一臺商用流式細胞儀FACS I，流式細胞術進入了一個空前飛速發展的時代。進入九十年代后，流式細胞術作為一門生物檢測技術已經日臻完善，儀器的硬件平臺也已達到穩定的技術狀態。科學家和儀器制造商又紛紛將研究的焦點轉向熒光染料的開發、單克隆抗體技術、細胞的制備方法以及提高電子信號的處理能力上來，以拓展日趨廣泛的應用領域。

流式細胞術的強大生命力植根于生物學、醫學的各個領域，正是這些日新月異、變化多樣的應用項目在全球范圍內推動了流式細胞術的發展。目前，利用流式細胞術不但可以對植物細胞進行計數、測量基因組大小、還能分析細胞周期、進行流式核型(染色體的DNA含量)分析、分揀染色體以及構建染色體文庫等。由于FCM分選系統可提供純度較高的特異性細胞群，因此利用流式細胞術分檢純化出的染色體在分子生物學后續研究領域有著廣闊的應用前景，例如利用PCR技術進行物理圖譜的繪制、FISH與PRINS遺傳圖譜的繪制、植物基因組的分析、染色體蛋白的免疫定位[27-3o]等。

近年來，FCM作為一種日漸成熟的技術， 已經深入到植物研究的諸多領域，給工農業生產和科學研究提供了一個強有力的工具。但是，這種技術還有一些自身的缺點，如價格昂貴、對操作人員要求高以及樣品需要復雜的前處理等，這都限制了流式細胞術在植物領域中的應用。然而，隨著新型多功能流式細胞儀的研制、多參數分析技術的建立以及各種分析軟件的開發，我們相信流式細胞術作為一種不斷完善的技術在植物學研究中將有更加廣闊的應用前景。