流式細胞術（FCM）之6大應用詳解：它能否成為未來醫學診斷的“金標準”？

　　導語

　　流式細胞術（FCM）——作為跨越一整個世紀，經過一代又一代科學家們不懈奮斗和努力下的結晶，現如今已經成為探索生物細胞奧秘的關鍵技術。FCM 是在細胞流動的狀態下，快速檢測細胞或顆粒物的熒光信號，從而判斷細胞的屬性及分化程度，實現細胞的定量分析和分選的技術。

　　由于 FCM 具有速度快、敏感性高、準確性好、采集數據量大、分析全面、方法靈活等優點，在免疫學、細胞生物學、生物化學等不同研究領域和臨床診療中起著至關重要的作用。在這場歷史長河中，諸多領域的科學家們共同見證了 FCM 從「無」到「有」的輝煌歷程。

　　那么，FCM 在感染性疾病、健康管理、自身免疫性疾病、血液疾病、腫瘤疾病、原發性免疫缺陷疾病等 6 大領域中如何應用？讓我們為大家一一揭開它的神秘面紗。

　　一、披荊斬棘的「前世」——第一臺熒光細胞檢測儀的誕生

　　1934 年，Moldaven 是世界上最早提出使細胞檢測自動化的人，他試圖用光電儀記錄流過 1 根毛細管的細胞數量，實現了從靜止細胞到流動細胞的微觀計數[1]。隨后，流式細胞術在 1936 年至 1950 年間，經歷了一段艱難的發展史（圖 1）。

　　1953 年，Parker 和 Hutcheon 研究出一種全血細胞計數器裝置，成為流式細胞儀的雛形[2]。

　　1969 年，在 Van Dilla Fulwyler 及其同事們的不懈努力下， 第一臺熒光檢測細胞計數器問世。在科學家們的不斷試驗與改進下，開創了細胞免疫熒光染色和檢測技術的新紀元。

　　1973 年，BD 公司與美國斯坦福大學合作，研制并生產了世界第一臺商用流式細胞儀 FACS I。自此，FCM 進入飛速發展的新時代。

圖 1 流式細胞術的發展史

　　二、蓬勃發展的「今生」——從人工手動到智能自動的華麗蛻變

　　自 20 世紀 80 年代以來，FCM 得到了迅速的發展。它從一個只有 Fulwyler, M. J. 等幾名專家發展和使用的技術平臺轉變為一個通用的實驗室工具和臨床診斷系統。近 20 年來，FCM 逐步完成從人工手動到全自動化流水線的蛻變，成長為一項為患者不斷謀求福祉的強大技術。

　　目前，FCM 已逐漸朝著標準化的方向發展，同一樣本即使在不同實驗室、不同操作人員、不同儀器上檢測結果也能保持完全一致，大大地為患者節省了重復檢測的時間和費用。

　　此外，為了提高整體疾病的診療水平，FCM 朝著方案互聯的方向發展，不同儀器間的方案可以直接復制，讓走在前沿的診療方案快速推廣到各級醫院，為加快區域醫療中心建設以及醫聯體 / 醫共體的建立做出了巨大的貢獻！

　　三、立足當下，展望未來——FCM 在六大領域中的應用

　　（一）FCM 在感染性疾病中的應用

　　1. 利用 FCM 檢測中性粒細胞表面的 CD64（nCD64）水平的意義

　　1）nCD64 可作為細菌感染的早期診斷指標：當機體受到感染時，nCD64 可在感染發生的 3～6 h 大量表達，發揮抗感染作用（圖 2）。nCD64 在診斷細菌感染方面具有較高的敏感性和特異性，遠優于 CRP 和 WBC 計數[3]。

圖 2 FCM 檢測 nCD64 的散點圖和直方圖

　　2）nCD64 指數有助于結核病的診斷和預后（圖 3）：一項納入 189 例活動性結核患者的研究顯示，nCD64 指數診斷結核性腦膜炎（TBM）的敏感性和特異性分別為 53.85% 和 100%。且 nCD64 指數可隨著患者病情的改善出現下降，并在治療后 4 周顯著下降[4]。

圖 3 結核分枝桿菌感染患者 nCD64 的差異表達

　　2. FCM 檢測單核細胞人類白細胞抗原-DR（mHLA-DR）有助于膿毒癥的診斷及預后評估

　　與健康人群相比，膿毒癥患者外周 mHLA-DR 顯著降低，膿毒癥第 3～4 日后患者 mHLA-DR 的快速恢復提示患者具有良好的臨床預后。反之，mHLA-DR 持續降低往往與不良臨床結局相關，如死亡、繼發性感染等[5]。

　　3. FCM 在新冠感染中的應用

　　中國人民解放軍總醫院王福生院士團隊發布在《柳葉刀呼吸醫學》[6]上的全世界首例新冠病毒感染病理解剖報告中揭示，患者外周血 CD4+ 和 CD8+ T 細胞數量大幅減少，但其狀態卻表現為過度激活。

　　淋巴細胞減少是新冠感染患者的共同特征（圖 4），并可能是與疾病嚴重程度和死亡率相關的重要因素。利用 FCM 進行外周血淋巴細胞亞群（TBNK）檢測，在新冠感染早期及時動態監測患者免疫功能變化、判斷病情發展，可以為疾病的轉歸和治療提供指導作用。

圖 4 長期新冠肺炎患者的病理特征變化[7]

　　（二）FCM 在健康管理中的作用

　　華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科副主任汪峰教授曾指出：「免疫力檢測聯合常規檢查能夠更精準地發現亞健康狀態，提示疾病風險」。TBNK 分析正是進行免疫力檢測的重要手段，利用 FCM 進行 TBNK 計數分析，對機體的免疫狀態進行精準評估，篩查免疫力低下的高風險人群，做到疾病的早發現、早診斷、早治療。

　　新冠病毒可破壞人體免疫系統，導致淋巴細胞的直接損傷、分化障礙、誘導凋亡等。中華醫學會健康管理學分會 2023 年《新型冠狀病毒感染康復期人群健康體檢特殊項目的專家共識》[8]提出：針對「陽康」后 3 個月內的人群，建議進行 TBNK 分析，從而評估機體免疫功能的恢復狀況，發現異常狀態后及時采取措施。

　　（三）FCM 在自身免疫性疾病中的應用

　　自身免疫性疾病的疾病活動主要與漿母細胞及短壽漿細胞分泌的抗體有關。應用 FCM 對患者外周血中漿細胞及細胞表面免疫標志進行分析，對疾病的診斷、預后判斷和治療監測都有一定的意義。

　　1. 外周血漿母細胞水平與系統性紅斑狼瘡（SLE）疾病活動度的變化呈現良好的相關性，是判斷 SLE 疾病活動度、預測復發的敏感指標。

　　2. 預測、評估 B 細胞靶向藥物療效，預防疾病復發：應用利妥昔單抗治療 6 個月后，檢測漿母細胞水平 > 0.0008 × 109/L 的患者，在接下來的 26 周和 52 周內的復發率分別為 90% 和 100%（圖 5）。因此，監測漿母細胞水平，可為疾病復發預警[9]。

圖 5 在 6 個月時檢測到血漿母細胞 > 0.0008 × 109/L，預示著更早的復發

　　（四）FCM 在血液疾病中的應用

　　FCM 通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和 DNA 的檢測分析，在各種血液病的診斷、預后判斷和治療中具有舉足輕重的地位。

　　1. 血液病免疫分型：2017 年《流式細胞學在非霍奇金淋巴瘤診斷中的應用專家共識》[10]指出，利用 FCM 對淋巴瘤進行免疫表型分析，可以實現白血病的診斷和治療。其中，有些淋巴瘤可以用 FCM 明確診斷，主要包括急 / 慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、漿細胞腫瘤、T 大顆粒淋巴細胞白血病等。

　　2. 微小殘留病變（MRD）監測：用多參數流式細胞術（MP-FCM）進行惡性血液病 MRD 監測，具有敏感性高、特異性好、適用范圍廣等優勢（圖 6）。2017 年《多參數流式細胞術檢測急性白血病及漿細胞腫瘤微小殘留病中國專家共識》表示，目前已成為惡性血液病臨床療效觀察和預后分層的重要依據[11]。

　　3. FCM 對其他種類血液病的診斷和治療監測：如陣發性睡眠性血紅蛋白尿。FCM 采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞 CD59 的表達做定量分析，輔助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度。

圖 6 1 例急性白血病患者獲得完全緩解后的 MRD 檢測設門策略

　　（五）FCM 在腫瘤診斷中的應用

　　TBNK 分析在調節免疫和特異性殺傷腫瘤細胞方面起著至關重要的作用。利用 FCM 進行 TBNK 分析，可精準評估腫瘤患者的免疫狀態，有助于早期診斷惡性腫瘤，進而為患者后續的治療提供指導和依據[12]，主要包括：

　　1. TBNK 監測可反映腫瘤患者免疫狀態：有研究顯示，非小細胞肺癌患者的淋巴細胞增殖能力明顯受損，各亞群細胞數量絕對減少，且 CD4+ T 淋巴細胞減少的患者總生存期低于 CD4+ T 淋巴細胞計數 > 500/uL 的患者（圖 7）[13,14]。

圖 7 研究隊列中 CD4+ T 和 CD8+ T 淋巴細胞減少與總生存率之間的關聯

　　2. T 細胞精細分型可在早期預測腫瘤發生：研究表明，CD4+ T 細胞計數和 CD8+ HLA-DR/CD8+ 和 CD8+ CD38+/CD8+ T 細胞百分比與腫瘤分期、淋巴結轉移、遠處轉移呈正相關，是預測腫瘤進展的潛在生物標志物（圖 8）[15]。

圖 8 淋巴細胞亞群水平在各種腫瘤疾病中的預測價值

　　（六）FCM 在原發性免疫缺陷病中的應用

　　原發性免疫缺陷病（PID）是遺傳因素或先天性免疫系統發育不良造成免疫功能障礙而引起的疾病，多在兒童階段發病。通過 FCM 開展免疫功能評估，在重點人群中早期發現和治療 PID 患者，可顯著提高患者的存活率，減少致殘率和臨床不良事件，提高患者生命質量。

　　1. 用 FCM 檢測 PID 相關蛋白及功能：某些 PID 可通過 FCM 檢測特定蛋白及其功能，快速篩選或確診，如 X 連鎖無丙種球蛋白血癥（XLA）、X 連鎖高 IgM 綜合征（XHIM）等[16]。

　　2. 對新生兒重癥聯合免疫缺陷病（SCID）進行篩查：目前已發現的 10 余種 SCID 致病基因共同特征為功能性 T 細胞完全缺如或顯著減少。因此，定量分析 T 細胞受體剪切環（TREC）進行初篩后，陽性和可疑患者可利用 FCM 進行淋巴細胞亞群數量檢測，以便進一步確診和排除疑似病例。

　　3. FCM 評估接種疫苗前兒童的免疫功能：由于免疫系統缺陷，PID 患者接種部分減毒活疫苗后無法激活免疫防護，反而導致嚴重不良反應甚至死亡[17]。在免疫接種過程中，利用 FCM 對接種兒童的免疫功能進行判斷和評估，可有效避免接種不適疫苗造成的感染和死亡。

　　小結

　　經過一個多世紀的發展之路，集多個學科的知識與智慧于一身的 FCM，具有快速、靈敏及能同時進行多參數分析等優點，已逐漸成為現代醫學中必不可少的監測技術手段。FCM 的應用涵蓋基礎研究到臨床實踐中的各個方面，可對不同學科的建設與發展起到重要作用。同時，可參與感染、健康管理、風濕、血液、腫瘤、兒科等多個學科的疾病診斷、微小殘留病變監測和預后評估，為臨床診療提供極大的幫助和便利。