淺談液相色譜柱的選擇

隨著HPLC的普及，分析方法學的開發成為一個合格的分析研究員的標配，而色譜柱的篩選是分析方法開發的第一步，也是最重要的一步，優秀的分析研究員可以根據化合物的結構特征很快確立所需的色譜柱，然后根據化合物的Pka，logP確立流動相。分析方法學的開發學問多多，本文就色譜柱的篩選進行簡單介紹。

1、HPLC色譜分離模式的選擇

在建立化合物的HPLC方法時，可以首先根據化合物的分子量大小，極性大小及PKa，選擇合適的分離模式，在適當的分離模式下去再去優化同類的色譜柱及流動相。化合物分子量<2000Da時，可根據圖1來選擇：

圖1 分子量<2000Da的分離模式

化合物分子量>2000Da時，可按圖2來選擇：

圖2 分子量>2000Da的分離模式

2、反相鍵合相色譜柱性能影響因素

在實際工作中所涉及的化合物絕大部分都可以使用反相色譜進行分離，下面先分析反相鍵合相色譜柱性能的影響因素，只有了解影響色譜柱性能的因素，才能結合目標分析物的性質、需要達到的分析效果及實驗室條件來選擇適合的色譜柱。

2.1 影響色譜柱性能的物理參數

(1) 硅膠純度

硅膠純度和殘留金屬離子濃度，硅膠的雜質會影響化合物的峰形，硅膠表面的金屬含量高會影響堿性化合物的峰形，易發生拖尾。

(2) 色譜柱尺寸

填料床的長度和內徑，增加色譜柱長度，可以在一定程度上提高柱效，但也會升高壓力和導致峰展寬；寬柱徑，提高載樣量，但也會增加橫向擴散，同樣會導致峰展寬。窄柱徑可以節約溶劑，可減少橫向擴散，但壓力較大，對系統要求較高。

(3) 顆粒形狀及粒徑

球形顆粒柱效高、重現性好、柱床結構均勻，不規則形柱床結構不均勻、流動相線速度不均勻，容易譜帶展寬；平均顆粒直徑，粒徑越小，柱效越高，柱壓也越高。粒徑分布越廣則柱效越低，壓力越大。

(4) 顆粒表面積

顆粒外表面和內部孔表面的總和，以m2/g表示，相對而言高表面積對樣品具有較強的保留能力，更大的柱容量和分離度。而低表面積能更快達到平衡狀態，更適合梯度洗脫程序。

(5) 孔徑

顆粒的孔或腔的平均尺寸，范圍是80~300?，大孔徑的填料顆粒可以延長大分子溶質在填料表面的滯留時間，改善分離，所以大孔徑填料適合分離大分子化合物或者水動力體積較大的分子。

2.2 影響色譜柱性能的化學因素

(1) 鍵合類型及鍵合相

鍵合相分子與基體單點相連為單體鍵合，這種鍵合方式可以提高傳質速率，縮短柱平衡時間，；聚合體鍵合為鍵合相分子與基體多點相連，這種鍵合方式可以增加色譜柱穩定性，增加載樣量。而鍵合相不同會直接影響化合物的保留行為。

(2) 碳覆蓋率

高碳覆蓋率可以提高分辨率和重現性，但分析時間長。

(3) 封端

硅膠鍵合相填料中有部分未封端的殘留硅羥基，如圖封端可以減輕待測組分與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應，改善保留和峰行，這對于堿性化合物尤其重要。而不同的封端技術也會直接影響色譜柱的效能。

圖3 硅膠鍵合相填料

3、反相鍵合相色譜柱的選擇

3.1 重現國標文獻中方法

選擇色譜柱粒徑、比表面積、基質表面特性、鍵合類型等相似的色譜柱，或者利用USP網站及一些色譜柱選擇軟件，如“column selector for acd/chemsketch”來查詢相似系數，選擇相似系數高的色譜柱。

3.2 建立新化合物分離分析方法的色譜柱選擇

根據目標分析物的分子量大小、溶解性、Pka值，以及分離要求、儀器、成本等各方面來選擇色譜柱。

(1) 根據分離目的選色譜柱，對映體分離常選擇手性柱，離子化色譜可選擇離子柱，蛋白多肽、DNA可選擇凝膠柱或離子交換柱，一般的小分子化合物可選擇普通反相柱，如C18、C8柱、苯基柱等等。

(2) 根據實際需求和設備選擇填料粒徑，普通HPLC一般選擇5μm或3.5μm粒徑的色譜柱，而UPLC則常使用1.7μm——3.5μm的色譜柱。

(3) 比表面積，高比表面積有助于分離，低比表面積更適合梯度洗脫程序。

(4) 孔徑，大分子化合物適合大孔徑，在保證比表面積的前提下，選擇孔徑大的。

(5) 鍵合相的選擇

• 直鏈烷基鍵合相C18和C8適合中等極性化合物，對于極性化合物可以選用硅羥基未封端或特殊封端的C18柱，如Agela Technologies的Venusil ASB C18柱；或者鍵入極性基團的C18柱，如圖4所示，waters的shield RP18柱就是這類；

圖4 鍵合極性基團的C18鍵合相和傳統C18鍵合相

還有一類是同時鍵合了烷基和陰、陽離子交換基團的C18柱，IMTAKT的Scherzo系列就是這類，圖5中所示的Scherzo-SS-C18同時鍵合了C18、陽離子和陰離子交換基團，也很適合于分離兩性化合物和弱極性化合物。例如廠家所給的應用譜圖中對于神經遞質的分析(圖6)，神經遞質在普通C18柱上保留和峰形都不太理想，Scherzo-SS-C18在不加離子對試劑的條件下就能達到很好的分離。

圖5 Scherzo-SS-C18

圖6 Scherzo-SS-C18和普通C18柱用于神經遞質的分析對比

• 對于芳香環較多的化合物，苯基柱是最佳的選擇，詳見下表

• HILIC，親水作用色譜，可以作為反相色譜的補充。

下表是常見的化學鍵合相及其運用范圍：

現在商品化的液相色譜柱琳瑯滿目，根據色譜柱的參數可以給我們提供一個初步的選擇，但由于各個儀器廠商的填料技術和鍵合技術都有差異，即使是C18柱，同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低PH值的、耐受高溫、耐受純水相和適合堿性分離等等。所以在使用色譜柱之前需要好好閱讀產品說明手冊，才能找到滿意的分離條件。