液相色譜柱使用說明

當今分析化學的領域，色譜分析占據了半壁江山，尤其是在藥物分析方面更是如此。例如《中國藥典》2005年版二部收載的藥物已有近43.1％的藥品質量標準不同程度的采用了高效液相色譜分析方法。尤其是復方制劑、雜質或輔料干擾因素多的品種多采用高效液相色譜法。應該指出的是與歐美國家占主流的化學制藥不同，中國的制藥產業一直由傳統中藥和現代西藥組成。因此在中國，對作為藥物分析的有力手段的HPLC色譜柱，提出了更高的要求：一方面要滿足中藥復雜成分的分離；另一方面能夠分離西藥中各種酸性和堿性化合物。2005版的《中國藥典》一部也大量增加了HPLC含量測定的品種，達479種，約占41.8％。面對法規的需要和競爭日趨激烈的藥物市場，科瑞公司從廣大用戶的利益出發，適時推出了物美價廉的高效液相色譜柱，以滿足這樣一種市場的需求。科瑞色譜柱適合分離各種中藥和西藥。同時具備良好的重現性和耐用性，科瑞色譜柱必將以其較高的性能價格比和良好的技術支持深受廣大用戶的歡迎。 液相色譜柱的安裝：

1、液相色譜柱的結構：空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。

在兩端柱接頭內，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網)，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失。空柱各組件均為316#不銹鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

2、色譜柱的安裝：

a、拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內貯存的溶劑。

b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。

c、 按柱管上標示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如條件允許，建議

在柱前使用保護柱)；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。在接管時一定要設法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現象，請用扳手繼續順時針擰1／4圈，直至不漏液為止。

液相色譜柱的使用：

色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。

高效液相色譜柱的選擇

現代高效液相色譜中，分離效果好壞的一個重要指標是色譜填料的選擇。但是目前市場上有多種色譜填料可供選擇，因此就必須對此有一定的認識和了解。

一、硅膠基質填料

1、正相色譜 正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團，如胺基和氰基的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基或其他極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。

2、反向色譜 反向色譜用的填料常是以硅膠為基質，表面鍵合極性相對較弱的官能團。反向色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。常用的反向填料有：C18、C8、C4等。

二、聚合物填料 聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要優點是在PH值為1～14均可使用。相對于硅膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物對蛋白質等樣品的分離非常有效。現有的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。

三、其它無機填料 其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化由于其特殊的性質，一般僅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質烷基鍵合相，石墨化碳黑的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳黑可用于分離某些幾何異構體，由于在HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強，可制成穩定的色譜柱柱床，其優點是可以在PH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強，應用范圍受到一定限制，所

以未能廣泛應用。新型色譜氧化鋯基質填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用PH1-14，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料是最近幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優勢尚在進行之中。

目前，商品化的色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5um填料。填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數或分離能力，但是柱長更短，以縮短分析時間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。 如何選擇保護柱？

怎樣選擇保護柱，但又不影響分離分析？通常，在選擇保護柱之前首先要考慮的是樣品是否清潔，對于大部分分析工作者來說，一只1cm長的保護柱便能提供充分的保護作用。但是，如果樣品非常不清潔，或工作中發現經常要更換1cm的保護柱，那么就應該選用2cm或3cm的保護柱，保護柱越長自然所裝填的色譜填料就越多，則其保護性能越好，當然隨著保護柱長度的增加，樣品的保留時間也相應增加，一般來說，保護柱的內徑與分析色譜柱的內徑相同或相當即可。另一種保護柱結構其實質是縮短了色譜分析柱，設計方式上有直連式/手緊式或整體式。整體式設計是由色譜柱的生產廠商直接安裝在色譜分析柱上的，必須與色譜分析柱一同訂貨，可以非常方便的使用，但不能被修改。直連式結構設計可以在任何時候由色譜工作者來安裝連接，可以與任何品牌的色譜柱連接使用，而且可以根據不同的樣品選擇合適的保護柱長度。手緊式保護柱從結構上講是與直連式保護柱一樣，只是在連接時不用借助扳手等工具，直接用手上緊即可。另外從保護柱結構的角度看，保護柱結構又分為是否可以更換保護柱柱芯。現在大多數的保護柱均可以更換柱芯，可以降低保護柱的使用成本。大多數人是根據色譜分析柱的填料來選擇保護柱的填料，正常情況下可以選擇與分析色譜柱一樣的色譜填料。但是，根據實際的分析工作，也可不必與分析色譜柱的填料完全匹配。

對于選擇保護柱的原則是：在滿足分離分析要求的前提條件下，盡可能的選擇較短的保護柱，盡可能選擇對分離樣品小一些保留性的填料。