液體活檢在臨床腫瘤診療的應用和醫學檢驗實踐（一）

液體活檢(liquid biopsy)在腫瘤臨床診斷治療領域的應用日益廣泛，是實現對腫瘤"個體化精準醫療"的重要手段。為科學規范液體活檢技術在臨床檢驗中的應用，中華醫學會檢驗醫學分會、國家衛生健康委員會臨床檢驗中心共同制定了《液體活檢在臨床腫瘤診療應用和醫學檢驗實踐中的專家共識》，并廣泛征求了臨床腫瘤專家和醫學檢驗專家的意見。

本應用建議最后經中華醫學會檢驗醫學分會和國家衛生健康委員會臨床檢驗中心組織專家進行討論修改后，由中華醫學會檢驗醫學分會、國家衛生健康委員會臨床檢驗中心共同發布。鑒于液體活檢技術發展迅速，本應用建議將適時修訂，以適應醫學發展和滿足臨床應用的需求。

液體活檢是指利用人體體液作為標本來源檢測獲取腫瘤相關信息的技術[1,2]。相比于傳統侵入式組織活檢，液體活檢具有依從性佳、標本易獲取、特異性好等優勢；更重要的是，其能有效克服腫瘤異質性，可有效實現精準的腫瘤輔助診斷、實時監測、療效評價及預后判斷[2]。因此，液體活檢有望成為癌癥早期輔助診斷、伴隨診斷、治療監測及預后評估的理想技術。液體活檢主要包括循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)和外泌體等檢測，其中ctDNA與CTC是目前最受關注的兩類液體活檢靶標[3,4]。ctDNA是指人體血液循環中攜帶有腫瘤特異性基因突變、缺失、插入、重排、拷貝數變異及甲基化等信息的DNA片段，其主要來源于壞死或凋亡的腫瘤細胞、循環腫瘤細胞或者腫瘤細胞分泌的外泌體[5]。CTC是指自發或被動地從實體腫瘤病灶脫落進入到血液循環的腫瘤細胞。作為腫瘤轉移/復發的"種子"，CTC攜帶有大量與腫瘤發生、發展、轉移以及耐藥相關的信息[6,7]。

在臨床實踐過程中應該謹慎評估液體活檢的分析有效性、臨床有效性以及臨床實用性[8]。本專家共識圍繞CTC和ctDNA兩種靶標，綜合近年來發表的液體活檢領域重要研究成果、結合我國腫瘤液體活檢的臨床實踐需求，就相關的臨床常用檢測技術的實施和質量管理提供常規指導原則。本共識主要分為兩大部分：(1)液體活檢的臨床應用，(2)液體活檢的醫學檢驗實踐。

第一部分　液體活檢的臨床應用

一、液體活檢技術的選擇

(一)ctDNA檢測技術的選擇

目前，實驗室常用的ctDNA檢測技術包括擴增受阻突變體系(amplification refractorymutation system，ARMS)、二代測序(next－generation sequencing，NGS)、數字PCR(digital PCR，dPCR)和核酸質譜檢測等。ARMS方法是目前獲得中國食品藥品監督管理局(China Food and DrugAdministration，CFDA)批準可用于臨床ctDNA檢測的方法，在臨床實踐中應用相對普及。由于NGS方法在技術與成本方面存在瓶頸，使得ARMS在檢測諸如EGFR等已知突變中具有明顯優勢。針對未知突變的發掘，NGS方法則具有其他方法無可比擬的技術優勢。包括Nature Medicine[8]、Lancet Oncology[9]及New England Journal of Medicine[10]在內諸多頂級期刊所報道的多項臨床試驗結果證實NGS在耐藥監測中具有重要的臨床價值：通過NGS監測可有效發掘耐藥新突變，及時調整干預措施，切實提高靶向治療療效。dPCR和基于質譜的核酸檢測方法盡管可應用于已知突變ctDNA的檢測，但僅限于實驗室自建，尚缺乏高等級循證醫學證據的支持，目前仍難以進入臨床實踐。基于上述研究結果與臨床實際，專家組認為檢測已知、單個靶向治療敏感或耐藥型突變時，建議使用ARMS方法；檢測已知、多個平行臨床治療靶點或發現未知基因、探索臨床價值與相關機制時建議使用NGS方法；dPCR具有驗證NGS檢測結果的潛能，但在應用前應當嚴格評估其檢測性能與臨床意義。

(二)CTC檢測技術

CellSearch平臺是目前唯一被CFDA批準用于定性檢測循環血中上皮來源腫瘤細胞的技術。其在判斷轉移性結直腸癌、乳腺癌及前列腺癌患者預后的臨床應用價值具有高等級循證醫學證據支持。但此檢測技術存在漏檢率較高、富集后CTC活性差難以進行后續基因組分析等缺點。其他檢測技術如免疫磁珠法和微孔過濾法等，盡管在多方面展現出優良的CTC檢測性能，但目前仍缺乏足夠的循證醫學證據支持其臨床應用。故臨床常規檢測CTC，建議各實驗室選擇適合自身條件的檢測技術，在充分評估其檢測性能后，應用于日常工作

臨床實踐中選擇液體活檢技術：

共識1　檢測患者ctDNA是否含有已知的、單個靶向治療敏感或耐藥型突變時，建議使用ARMS方法。

共識2　檢測患者ctDNA已知的部分或全部臨床藥物治療靶點譜或耐藥指示靶點譜，或發現患者基因未知突變、探索臨床價值與相關機制時建議使用NGS方法。

共識3　臨床常規檢測CTC，建議各實驗室選擇適合自身條件的檢測技術，在充分評估其檢測性能后，應用于日常工作。

二、液體活檢的應用范圍

(一)腫瘤早期輔助診斷

1．ctDNA早期輔助診斷價值：

隨著檢測技術敏感度提高，目前ctDNA已可在早期肝癌、結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌以及肺癌患者循環中被檢出[11,12,13]，提示ctDNA對于這幾種惡性腫瘤具有早期輔助診斷潛能。必須注意的是，特定突變例如P53突變可在健康人群中被檢出[14]；此外，可用于早期診斷輔助ctDNA分子譜在不同癌種變異度較大且都未經過大樣本臨床驗證，實際效能仍不明確[15]。因此，需要探索更加特異的ctDNA分子譜并設計大規模前瞻性臨床試驗證實其價值，目前距離真正臨床應用還有較大距離。

2．CTC早期輔助診斷價值：

既往CTC研究多集中于其轉移/復發的預測價值[16,17,18]。近年來研究證實CTC的釋放是一種腫瘤早期事件，提示CTC對腫瘤早期輔助診斷具有重要價值[19,20,21]。然而非腫瘤患者例如炎癥性腸炎或慢性肝炎患者體中可檢出低水平的假陽性結果[21,22]。由此可見，目前CTC并非一種完美的早期輔助診斷靶標。此外，目前也缺乏CTC展現出優于影像學診斷的臨床證據。綜上，現階段CTC仍不適合單獨用于腫瘤早期輔助診斷，需要更多的循證醫學證據證明其價值。

(二)指導臨床用藥

1．ctDNA的臨床用藥指導作用：

腫瘤精準治療可通過檢測腫瘤相應的基因信息，選擇合適的靶向藥物用于后續治療。故ctDNA檢測可提供十分重要的參考信息。截止2018年3月，主要腫瘤相關基因改變的靶向藥物選擇如表1所示。

表1 腫瘤相關基因改變與靶向藥物選擇

需要注意的是，目前ctDNA檢測僅在非小細胞肺癌中被美國食品藥品監督管理局(Food and DrugAdministration，FDA)批準用于指導EGFR酪氨酸激酶抑制劑選擇并寫入美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南。對于其他藥物選擇，目前仍處于探索階段，尤其在檢測T790M時，對陰性結果應盡可能通過后續的組織檢測進行確認。因此，未來還需要更多前瞻性循證醫學證據來支撐ctDNA的指導作用。

2．CTC的臨床用藥指導作用：

CTC作為完整細胞，具有多種來源的腫瘤信息，包括蛋白、DNA突變、編碼及非編碼RNA信息等[18]。針對CTC的體外培養與藥敏實驗被證明可用于篩選靶向藥物，具有巨大的臨床轉化潛能[4,34]。但是，現有臨床CTC檢測體系在活性CTC分離問題上仍存在關鍵性的技術瓶頸，尚不能滿足提供多元化信息以指導靶向用藥的臨床需求；其他CTC分離檢測技術或指導價值不明確或短時間內難以轉化。故盡管CTC檢測對于指導臨床實行精準治療具有重要的潛在價值，但在更先進的技術和更可靠的臨床證據出現之前，不鼓勵在實際臨床工作中用其指導靶向化療。

(三)靶向藥物伴隨診斷

1．ctDNA在靶向藥物伴隨診斷中的應用：

靶向藥物使用過程中實行伴隨診斷有助于確保藥物安全性與有效性，是執行"精準醫療"理念的核心步驟之一。因此，伴隨診斷在臨床腫瘤綜合管理中的價值愈發顯著。截至2018年4月，已有多種靶向藥物伴隨診斷系統被FDA批準用于實際臨床工作，常見適用伴隨診斷的藥物及其靶點如表2所示。

表2 常見適用伴隨診斷的藥物及其靶點

ctDNA檢測相對于常規組織活檢具有非侵入性、患者依從性好、異質性低、可反復取材等優勢，其在靶向藥物伴隨診斷中具有很大的優勢[1]。目前，ctDNA檢測應用于非小細胞肺癌EGFR靶向治療伴隨診斷已被NCCN寫入指南。未來伴隨著更先進技術以及更多臨床證據的出現，將會有越來越多ctDNA檢測用于靶向藥物伴隨診斷。

2．CTC在靶向藥物伴隨診斷中的應用：

目前并無循證醫學證據提示CTC可應用于伴隨診斷，但小規模研究顯示CTC分子譜分析對于靶向藥物伴隨診斷具有積極意義[35]。未來需要更多的高級別臨床證據充分探索CTC在伴隨診斷中的作用。

(四)實時療效監測

1．ctDNA實時療效監測價值：

相比傳統的影像學與血清蛋白類腫瘤標志物，ctDNA在反映療效方面具有更好的特異性與敏感度，理論上可準確反映機體腫瘤負荷的細微變化[1]。已有小規模隊列研究證實連續監測腫瘤患者體內ctDNA突變豐度的變化可反映治療后個體腫瘤負荷變化，及時提示臨床更換有效的治療策略[6,18,36]。但是，目前ctDNA檢測存在重復性不佳、不同實驗室間檢測結果一致性較差、檢測結果在不同實驗室間互換性低、缺乏量化DNA負荷的最佳單位等缺陷，嚴重制約了ctDNA在臨床實踐中的應用價值[37]。因此，檢測ctDNA反映實時腫瘤療效仍處于臨床前階段，亟待技術進步與大規模RCT研究來充分驗證其價值。

2．CTC實時療效監測價值：

CTC在反映療效中的優勢在于其信息的多維性，除數量變化外還可提供豐富的參數供臨床分析，從而系統地描繪出腫瘤演進分子圖譜。研究顯示CTC動態變化與療效顯著相關，且較影像學與蛋白類標志物展現出更好的敏感度與特異性[7,38]。但是，在現有檢測技術條件下其療效評估效能略遜于ctDNA，且CTC檢測存在諸如重復性較差、循環空間異質性、缺乏理想分離方案等缺陷，限制其大規模臨床應用[17]。因此，CTC暫時不是一種可直接應用于臨床療效監測的理想靶標，其轉化有待更好的檢測技術出現與更多的臨床證據證實。

(五)腫瘤進展與不良預后早期預警

1．ctDNA早期預警作用：

ctDNA檢測對于包括肺癌、結直腸癌、乳腺癌在內的多種實體瘤進展具有重要預警價值，其豐度改變可早于影像學發現復發/轉移灶[1]。這意味著可通過ctDNA檢測篩選出復發/進展高風險的患者，為其在臨床進展前創造干預治療的機會。此外，ctDNA豐度也與腫瘤患者無病生存期(disease free survival，DFS)以及總體生存期(overall survival，OS)密切相關，特定亞克隆ctDNA的檢出對預測患者預后具有重要預測價值[37]。但是，目前大部分報道為小樣本研究，缺乏大樣本、多中心、前瞻性設計的臨床試驗；此外亦缺乏高級別循證醫學證據支持患者能夠從ctDNA指導的臨床決策中獲得比常規腫瘤管理更多的臨床收益[8,36,37]。因此，臨床轉化ctDNA用于腫瘤進展與不良預后早期預警仍需要更多的高級別循證醫學證據。

2．CTC早期預警作用：

CTC檢測被FDA審批可用于預警轉移性結直腸癌、轉移性乳腺癌、轉移性前列腺癌患者的疾病進展/不良預后[18]。對其他實體惡性腫瘤例如惡性黑色素瘤、肝癌、胃癌等，CTC也展現出良好的預測價值[39]。但是，目前仍缺乏足夠的循證醫學證據支持CTC檢測在其他惡性腫瘤中的早期預警價值。未來需要更多設計良好的臨床試驗來證實CTC在腫瘤進展/不良預后早期預警中的價值。