液相色譜柱如何選擇

基材

色譜柱的基質分為硅膠基質填料，聚合物基質填料，其他無機填料。

硅膠基材填料：

1、正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有較強極性的官能團，如氨基基團和氰基基團的鍵合相填料。

由于硅膠表面的硅羥基（Si-OH）或其他基團的極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中的各組份的極性大小，即極性弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷、氯仿、二氯甲烷等。

2、反相色譜

反相色譜填料常是以硅膠為基礎，表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水，緩沖液與甲醇，乙腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合最先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。

常用的反相填料有C18、C8、C4、Phenyl等。

聚合物基材填料

聚合物基材多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優點是在pH值為1-14均可使用。

相對與硅膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白質等樣品的分離非常有效。

聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效教低。

其他無機填料

其它無機填料的色譜柱也已經商品化。由于其特殊的性質，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強，石墨化碳可用于分離某些幾何異構體；又由于在HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何pH與溫度下使用。

氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強，可制成穩定的色譜柱柱床，其優點是可在pH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應用。

新型氧化鋯填料也可用于 HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用pH范圍1~14，溫度可達到1000℃。由于氧化鋯填料幾年前才開始研究，加之前的實驗難度，其重要用途與優勢尚在研究中。

柱子的pH使用范圍

反相柱優點是固定相穩定，應用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質的填料，使用時一定要注意流動相的pH范圍。一般的C18柱pH值范圍都在2~8，流動相的pH值小于2時，會導致鍵合相的水解；當pH值大于7時硅膠易溶解；經常使用緩沖液固定相要降解。一旦發生上述情況，色譜柱入口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相pH較高或經常使用緩沖液時，建議選擇pH范圍大的柱子。比如Waters的XBridge系列色譜柱，pH使用范圍在1-12，對堿性化合物具有很好的分離能力。

填料的端基封尾

把填料的殘余硅羥基采用封口技術進行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩定性好了，組分的保留時間重現性就好。如果待分析的樣品是酸性或堿性的化合物，最好選用填料經端基封尾的色譜柱。

怎樣選擇填料粒度

目前，商品化的色譜料粒度從1μm到超過30μm均有，而目前分析分離主要用3、5、10μm填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3μm的填料應用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很用有的，3μm填料填充柱的柱數比相同條件下的5μm填料的柱效提高近30%；然而，3μm的色相譜的背壓卻是5μm的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。