液質聯用法測定牛奶中5種β內酰胺類抗生素

液質聯用法測定牛奶中5種β-內酰胺類抗生素

　　隨著我國經濟發展水平和生活水平的提高，牛奶逐漸成為中國城市居民日常生活中必不可缺的主要膳食成分之一。隨之而來的牛奶中的抗生素殘留問題也日益受到政府的重視。β-內酰胺類抗生素被廣泛應用于獸藥中，該類獸藥的殘留會引起敏感人群過敏。經常飲用含有殘留抗生素的牛乳會誘導產生耐藥菌株，給人類帶來潛在的危害。歐盟和美國FDA等對上述抗生素的殘留量都有嚴格的規定(表1)，并都有年度殘留的監控計劃。

　　對牛乳中β-內酰胺類抗生素殘留的分析較多的是采用傳統的微生物法及高效液相色譜法（HPLC）等。HPLC法[1,2]常常需要衍生化反應，衍生化效率難于控制，其重現性不是很好。Sonja Riediker等[3]及Holstege等[4]分別采用LC―MS測定牛奶中內酰胺類抗生素殘留，但前者的方法中操作步驟較繁瑣，后者采用的內標是有可能存在的同類抗生素。我們參考兩者的測定方法，研究建立了牛奶中5種殘留抗生素的測定方法。

　　1 實驗部分

　　1．1 主要儀器、試劑與材料

　　Waters 2695-Quttro Primier高效液相色譜儀-質譜儀；色譜柱為Waters 公司的Atlantis C18 （150 mm×2.1 mm,3.5 μm)色譜柱；離心機( 瑞江RJ－TDL－5A)；氮吹儀( ZymarkTurboVap LV EVAPORATOR)；固相萃取儀（SUPELCO Visi PREP DLTM）；Milli―Q超純水器(美國Milliporeco公司)； IKA MS1型旋渦混合儀；固相萃取柱（Waters oasis HLB 3cc）。

　　標準品阿莫西林、氨芐西林、青霉素、氯唑西林鈉、苯唑西林鈉（純度為99% ）及同位素內標（青霉素-D7）均購自Dr. Ehrenstorfer 公司。

　　標準儲備液的配制：分別稱取阿莫西林、氨芐西林、氯唑西林鈉、苯唑西林鈉及青霉素G各10 mg，用水溶液溶解并定容至10 mL。各儲備液濃度均為1.0 mg/mL。于冰箱中-20℃儲存。青霉素-D7內標溶液的配置：準確稱取10 mg內標，用50%甲醇定容至10 mL棕色瓶中，混勻，于冰箱中-20℃儲存。乙腈、甲酸及磷酸二氫鈉均為分析純。牛奶為市售產品。

　　1．2 實驗方法

　　1.2．1 樣品的處理 取5 mL牛奶置于50 mL離心管中，加入20 μL濃度為1 μg/mL的內標物，加入5 mL乙腈并渦旋1 min，再加入10 mL乙腈，充分搖勻，然后3 000 rpm離心5 min。吸取上層清液10 mL于60℃下用氮氣吹近干，加入3 mL磷酸鹽緩沖液（pH=4.5）。超聲溶解。將該溶液注入平衡好的HLB（先用3 mL甲醇洗滌小柱，然后再用3 mL水淋洗），先用水淋洗，然后用3 mL60%乙腈洗脫。收集洗脫后氮吹至干，用0.5 mL乙腈∶0.1%甲酸水（1∶1）溶解，15 000 rpm離心，上清液供液相色譜－質譜儀進行檢測。

　　1.2.2 色譜條件 柱溫：25℃； 進樣量：10 μL；流速：0.2 mL/min；樣品運行液相條件：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈溶液；0~ 2 min ，A的濃度為98%；2~15 min，A的濃度降至55%；15~25 min，A的濃度為10%；28.5 min開始，A的濃度回復至98%；自動進樣器進樣，采用等梯度洗脫方式。

　　1.2.3 質譜條件 電離源:ESI；電離模式: 正離子模式；毛細管電壓:3.2 kV；源溫度:100 ℃；脫溶劑溫度:450 ℃；脫溶劑氣流量:500 L/h；電子倍增電壓:650 V；碰撞室壓力:1.0×10-4mbar；分析器低端分辨率：13.5 V；高端分辨率：13.5 V；優化錐孔電壓及碰撞電壓，使定量或定性的離子碎片的豐度達到最大。5種抗生素色譜和質量條件及參數見表2。

　　2 結果與討論

　　2．1 色譜條件的優化

　　曾嘗試了SunfireC18和Symmetry C18和Discovery C18（均為150 mm×2.1 mm, 3.5 μm）等色譜柱，盡管這些色譜柱也能分離這些化合物，但對于出峰最早的阿莫西林的保留都不是十分滿意。阿莫西林可能是這些水溶性化合物中極性最強的物質，在其他色譜柱比較難以保留，而Atlantis色譜柱對于極性強的親水化合物具有特別的吸附能力，極大地改善了阿莫西林在其他色譜柱出峰早保留短暫的現象, 使阿莫西林在色譜柱也有很好的保留，且得到的色譜峰型較尖銳。所以最終選擇了 Waters公司的Atlantis C18色譜柱。在流動相的選擇過程中，曾比較不同梯度的甲醇、水體系，乙腈、水體系，后者的分離效果及柱壓明顯好于前者，因此選擇了乙腈、水體系。為了增強分離效果及提高質譜中的離子化效率，對比了甲酸、乙酸、三氟乙酸等，最終確定了0.1%甲酸水、乙腈體系。在上述選定色譜測定條件下，藥物峰與干擾峰可獲得良好分離（圖1）。

　　2．2 樣品提取條件的選擇

　　參考文獻〔3〕、〔4〕的提取方法，比較了磷酸鹽緩沖液、乙腈等兩種溶劑的提取效果，尤其對阿莫西林的提取，乙腈的提取效果優于磷酸鹽溶液。同時還比較了不同的固相萃取柱HLB、MCX、MAX對待測物的凈化效果，HLB柱的處理效果最好。在洗脫HLB色譜柱時，比較了乙腈的比例為40%、60%及80%時的洗脫液，60%的洗脫液已足以將HLB柱上的待測物洗脫干凈。

　　2．3 線性范圍、線性回歸方程及定量限

　　校正曲線的制作：分別吸取濃度為1 μg/mL的5種標準品的混合標準溶液10、15、20、25、50、100 μL，加入到5 mL的牛奶中，并分別加入1 μg/mL的內標溶液20 μL，以下步驟與樣品的處理方法相同。其標準系列濃度分別為2、3、4、5、10、20 ng/mL，依次進樣，進樣量均為10 μL，以標樣濃度為橫坐標，標樣峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標，分別作標準工作曲線，其相關系數及回歸方程見表3。在2~20 ng/mL的范圍內待測物的峰面積與內標峰面積比與濃度呈現良好的線性相關性，線性相關系數(R2 )為0.9943～0.9981。以信噪比S/N≥10作為確定最低定量限的標準，阿莫西林、氨芐西林、青霉素、氯唑西林、苯唑西林的最低定量限分別為5、2、2、4、4 μg/L。 

　　2．4 精密度試驗 

　　以牛奶加標樣作為陽性試樣，做10次重復試驗，分別進樣10 μL，計算結果見表4。

　　2．5 回收率測定

　　分別取樣5份，加入20 μL濃度為1 μg/mL的內標物，按上述處理方法進行測定，分別測量5份加標牛奶中待測物質與內標的峰面積比，并計算出各加標樣品的回收率。樣品中5種抗生素的添加水平分別為5、10 ng/mL。在牛奶中提取回收率為88.4%～126.6%。相對標準偏差(RSD)均<13.0%（表5）。

　　2．6 樣品測定

　　利用以上建立的方法，測定了從超市中購買的光明、優倍、優佳等品牌的牛奶，均未檢出以上抗生素。圖2為優倍牛奶的MRM譜圖。

　　2. 7 標準貯備液與樣品的穩定性

　　 標準貯備液應存放在-20℃冰箱中，有效期限為1個月。新鮮的牛奶如需保存，最好分份并冷凍保存。

　　2. 8 牛奶中的干擾物實驗

　　 利用本文中的處理方法處理了市售的數種無抗奶，僅發現某些牛奶中在阿莫西林出峰的位置有少許干擾峰出現，但并不影響阿莫西林的測定。