淀粉酶活性的測定實驗

實驗方法原理：α-淀粉酶及β-淀粉酶，各有其一定的特性，如β-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下則發生鈍化，通常提取液同時有兩種淀粉酶存在，測定時，可根據它們的特性分別加以處理，鈍化其中之一，即可測出另一酶的活性。將提取液加熱到70℃維持15分鐘以鈍化β-淀粉酶，便可測定α-淀粉酶的活性。或者將提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以處理，鈍化α-淀粉酶的活性，以測出β-淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3，5-二硝基水楊酸試劑測定。由于麥芽糖能將后者還原生成3-氨基-5-硝基水楊酸的顯色基團，在一定范圍內其顏色的深淺與糖的深度成正比，故可求出麥芽糖的含量，以麥芽糖的毫克數表示淀粉酶活性的大小。

實驗步驟	一、 實驗材料儀器及試劑 1、實驗材料：萌發的小麥（芽長1厘米左右） 2、儀器：（1）小臺秤；（2）研缽；（3）容量瓶：100毫升×1；（4）具塞刻度試管25毫升×13；（5） 試管：8支；（6）刻度吸管：1毫升×2，2毫升×2；（7）離心機；（8） 恒溫水浴； （9）分光光度計。 3、試劑： （1）1%淀粉溶液； （2）0.4 N NaOH； （3）pH5.6的檸檬酸緩沖液：A、稱取檸檬酸20.01克，溶解后稀釋至1升；B、稱取檸檬酸鈉29.41克，溶解后稀釋至1升。取A液13.7毫升與B液26.3毫升混勻，即為pH5.6之緩沖液。 （4）3,5-二硝基水楊酸：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1克溶于20毫升1N氫氧化鈉中，加入50毫升蒸餾水，再加入30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100毫升，蓋緊瓶塞，勿使二氧化碳進入。 （5）麥芽糖標準液：稱取麥芽糖0.100克溶于少量蒸餾水中，仔細移入100毫升容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。 二、操作步驟： 1、酶液的提取： 稱取2克萌發的小麥種子（芽長1厘米左右），至研缽中加一克石英砂，磨成勻漿倒入25毫升具塞刻度試管中，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻后在室溫（20℃）下放置，每隔數分鐘震蕩一次，放置15-20分鐘，離心，取上清液備用。 2、α-淀粉酶活性的測定： （1）取試管4支，注明兩支為測定管。 （2）于每管中各加酶提取液1毫升，在70℃恒溫水浴中（水溫度的變化不應超過±0.5℃）準確加熱15分鐘，在此期間β-淀粉酶受熱而鈍化，取出后迅速在自來水中冷卻。 （3）在試管中各加入1毫升pH5.6檸檬酸緩沖液。 （4）向對照管中加入4毫升0.4N氫氧化鈉，以鈍化酶的活性。 （5）將測定管和對照管置40℃（±0.5℃）恒溫水浴中保溫15分鐘，再向各管分別加入40℃下預熱的淀粉溶液2毫升，搖勻，立即放入40℃水浴中準確保溫5分鐘后取出，向各測定管迅速加入4毫升0.4N氫氧化鈉，以終止酶的活動，然后準備下步糖的測定。 3、α-淀粉酶及β-淀粉酶總活性的測定： 取上述酶液2-6毫升，放入容量瓶中，用蒸餾水稀釋至100毫升（稀釋程度視酶活性大小而定）混合均勻后，取4支試管，各加入稀釋之酶液1毫升及1毫升pH5.6之檸檬酸緩沖液。以下步驟重復α-淀粉酶的第（4）及（5）的操作，同樣準備糖的測定。 4、麥芽糖的測定： （1）取25毫升刻度試管7個，編號，分別加入麥芽糖標準液（1毫克/毫升）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0毫升，置沸水浴中準確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25毫升，用分光光度計在520nm波長下進行比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標，以麥芽糖含量為橫坐標繪制標準曲線。 （2）樣品的測定：取以上各管中酶作用后的溶液及對照管中的溶液各2毫升，分別放入25毫升具塞刻度試管中，再加入2毫升3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻，置沸水中準確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25毫升，混勻。用分光光度計在520nm波長下進行比色，記錄消光值，從麥芽糖標準曲線中查出麥芽糖含量，然后進行結果計算。
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