清華大學《Cell》文章：解決多個技術難題，終發首發性成果

　　清華大學生命學院再次發表了一最新結構生物學成果：首次報道了人源核酸內切酶Dicer蛋白的全長高分辨率結構，同時還報道了人源核酸內切酶Dicer蛋白結合一種小RNA前體pre-let-7底物的兩種不同結構狀態。

　　這一研究成果公布在Cell雜志上，文章通訊作者為清華大學生命學院、清華-北大生命科學聯合中心王宏偉教授，第一作者為博士后劉忠民、王家，以及博士生程航和柯鑫。

　　雖然這些結構生物學成果好像不要錢似的一篇一篇的發，讓人羨慕嫉妒恨，但其實科研人員花費了許多心思，攻克了多個問題，比如這篇文章就是在解決了蛋白質樣本準備、冷凍樣本制備、數據收集及處理等多方面的技術難題之后，才最終采用從哺乳動物293F細胞系中共表達蛋白復合體，親和層析分離純化蛋白質，采用純金或者鍍金載網制備出了分布較為均一、優勢取向相對較少的冷凍電鏡樣品，獲得了人源Dicer及其輔因子蛋白TRBP復合體的高分辨率三維結構。

　　NA干擾（RNAi, RNA interference）是敲低一個基因表達的最為常用的一種手段。內源性引起RNA干擾的小RNA主要是微小RNA （miRNA）。 到目前為止，人體內已經發現多達1800種微小RNA，越來越多的文獻報道認為很多腫瘤的發生發展、轉移等行為與微小RNA的異常表達密切相關。

　　人體內絕大部分微小RNA成熟形成都離不開一種核酸內切酶，我們稱之為Dicer的蛋白。有趣的是人體內只有一個拷貝的核酸內切酶Dicer基因,表達唯一的一種人源核酸內切酶Dicer蛋白，然而卻負責人體內絕大部分微小RNA的形成。因此，核酸內切酶Dicer蛋白在人體細胞中的重要性不言而喻。核酸內切酶Dicer蛋白是一種只切割雙鏈RNA底物的內切酶，分子量大小約為220 kDa，有多個結構域組成。其中有的結構域負責結合RNA底物，有些結構域負責切割RNA底物，還有些結構域就像一把尺子，精確測量出RNA需要被切割的位置。人源核酸內切酶Dicer蛋白能夠識別細胞內眾多不同的微小RNA前體底物，然后加工生成具有共同特征的長度約為22堿基和3＇末端有兩個游離堿基的成熟小RNA。

　　遺憾的是,人源核酸內切酶Dicer蛋白的整體三維結構一直沒有得到解析， 人源核酸內切酶Dicer蛋白是如何精確加工這些微小RNA前體的機制至今仍然不清晰。人源核酸內切酶Dicer蛋白一直沒有獲得高分辨率三維結構的主要原因有幾點：1、人源核酸內切酶Dicer蛋白約為220 kDa，對于運用晶體學來獲得三維結構來說，分子量比較大，很難結晶；2、對于運用單顆粒重構的方法來獲得高分辨率三維結構來說，其分子量又相對較小；3、核酸內切酶Dicer蛋白三維結構呈L型，沒有對稱性，在冰中分布多為長條型，襯度低，分布不均勻，有優勢取向，對單顆粒三維重構形成了很大的技術障礙。

　　過去十年的時間里，王宏偉以及其他課題組都嘗試運用單顆粒電鏡的方法去解析人源核酸內切酶Dicer蛋白的三維結構。經過不斷地摸索，研究組解決了蛋白質樣本準備、冷凍樣本制備、數據收集及處理等多方面的技術難題，最終采用從哺乳動物293F細胞系中共表達蛋白復合體，親和層析分離純化蛋白質，采用純金或者鍍金載網制備出了分布較為均一、優勢取向相對較少的冷凍電鏡樣品，并獲得獲得了人源Dicer及其輔因子蛋白TRBP復合體的高分辨率三維結構（4.4 埃）（上圖），首次解析了人源核酸內切酶Dicer蛋白的高分辨率整體結構，看到了核酸內切酶Dicer蛋白中各結構域的精確三維分布及結構域之間的空間關系。

兩種hDicer-TRBP-pre-let-7復合體的冷凍電鏡結構

　　為了更進一步了解人源核酸內切酶Dicer蛋白是怎樣加工微小RNA前體的過程，王宏偉研究組通過體外重組的方法獲得了人源Dicer-TRBP復合體與一種微小RNA的前體 pre-let-7所形成的三元復合體，并解析了該復合體的兩種三維結構狀態。

　　一種是pre-let-7的莖部呈完全互補結構（hDicer-TRBP-pre-let-7 complex class I），另一種是pre-let-7的莖部呈部分解離的狀態（hDicer-TRBP-pre-let-7 complex class II）（上圖）。王宏偉研究組與清華大學張強鋒研究組合作，通過化學修飾測序（icSHAPE）、核糖核酸酶酶切、測序膠電泳等技術，發現pre-let-7在溶液中呈動態的構象平衡，一部分pre-let-7的莖部是完全配對的雙鏈螺旋結構，也有一部分pre-let-7的莖部是呈部分解離的狀態。

　　深入的研究表明人源Dicer蛋白與TRBP形成的復合體與pre-let-7結合可以促進該RNA向莖部完全配對的雙鏈螺旋結構轉換，確保其莖部在被Dicer蛋白切割前的構象均一性，從而保證微小RNA產物的精確長度。正是這個機制有可能保證了人源Dicer蛋白精確地將眾多結構特征不同的微小RNA前體切割成具有共同的22nt長度的產物。這項工作為進一步解析微小RNA的成熟機制奠定了基礎。