湖南農業大學最新文章比對兩種基因組編輯技術

　　TALEN(Transcription activator-like effector nucleases)系統和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系統是當前廣泛應用的兩大基因組編輯技術。

　　來自湖南農業大學生物科學技術學院等處的研究人員比較分析了水稻(Oryza sativa L.)中這兩大系統誘導突變的突變率、突變類型、突變位置、突變時間和遺傳模式,解析了雙靶點 CRISPR/Cas9 系統的突變特征，以期為這兩種技術更好的應用于水稻功能基因組研究和分子植物育種提供理論參考。

　　近年興起的基因組編輯技術以其能精確修飾DNA 的特性，成為當前最受矚目、最有影響力的生物技術之一，在基因組功能研究、作物遺傳改良、基因治療等方面得到廣泛應用。基因組編輯技術以鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)、 成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9, CRISPR/Cas9)為代表， 已在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)等多種高等植物中成功實現了基因的定點敲除、敲入、替換等修飾。其中， TALEN、CRISPR/Cas9 分別被 Science 雜志評為 2012 年度、2013 年度十大科技進展之一。在作物性狀改良方面，二者均展現出很好的應用前景。

　　水稻是重要的單子葉模式植物，也是主要的禾本科糧食作物。研究 TALEN、 CRISPR/Cas9 在水稻中誘發的突變特征及遺傳穩定性，對這兩種技術應用于水稻基礎研究和育種實踐具有重要意義。目前，已報道的研究多聚焦于靶標性狀的獲得和靶向突變的效率分析，僅少數報道統計了這兩種系統在水稻單個靶位點引入的突變基因型、并分析了遺傳模式及脫靶效應。

　　這項研究比較分析了 TALEN 和CRISPR/Cas9 兩大系統靶向誘變水稻的突變率、突變類型、突變位置、突變時間和遺傳規律，解析了

　　雙靶點 CRISPR/Cas9 系統的突變特征。

　　這兩大系統都以誘發10 bp以內的InDel突變為主,TALEN系統易誘導10 bp以內的缺失突變,而CRISPR/Cas9系統易誘導1 bp的插入突變,且CRISPR/Cas9系統誘發的DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks,DSBs)位置更加精確。此外,DSBs在修復過程中能以低頻同源重組(Homologous recombination,HR)途徑修復,產生DNA片段重復突變。

　　對于相鄰雙靶點CRISPR/Cas9系統而言,雙靶點間的DNA片段可發生缺失或倒位,這種雙靶點間DNA片段突變的發生頻率與雙靶點各自的突變率無正 相關性。兩大系統誘導的突變最早發生在已轉化的愈傷組織中,少量發生在水稻的體細胞中,導致了純合突變、雜合突變、雙等位突變和嵌合突變4種遺傳模式,其 中雙等位突變比例最高,嵌合突變比例最低。除嵌合突變外,純合突變、雜合突變、雙等位突變的突變序列均可穩定遺傳給下一代。

　　作者指出，一個理想的基因組編輯技術應具有以下特點：

　　(1)靶向突變活性高，轉基因低世代有較高的突變率；

　　(2)突變位點特異，脫靶率低；

　　(3)突變類型多樣，易

　　于找到符合要求的突變體；

　　(4)有一定比例能穩定遺

　　傳的突變體；

　　(5)對于應用研究而言，在轉基因低世

　　代(如 T1 代)易徹底分離所有的轉基因成分。

　　這項研究發現，用農桿菌介導 TALEN 系統和 CRISPR/Cas9系統轉化水稻最早可在愈傷組織發生突變，在 T0 代能有效或高效地獲得可穩定遺傳的各種突變體，通過選擇特異性高的 CRISPR/Cas9 靶序列，可以有效控制脫靶效應。此外，研究(未發表數據)表明，在 T1代轉基因分離群體中可以篩選到不含轉基因成分的純合突變體和雙等位突變體。

　　相比 TALEN 系統而言， CRISPR/Cas9 具有不少優勢：靶序列更廣泛、載體構建更簡單、突變更高效，不受 DNA 甲基化影響，可同時敲除多達 8~10 個靶位點，易形成靶點間 DNA 片段缺失等突變。因此，總體而言CRISPR/Cas9 是更為理想的基因組編輯工具，但對于玉米等只有一小部分基因組轉錄本能找到 CRISPR/Cas9 特異靶位點[29]的物種而言， TALEN 系統則提供了一個相對特異的基因組編輯方式。