溶出度實驗、測定方法驗證

圖1.  供試品溶液圖譜（上）與對照品溶液圖譜（下）相比，基線被整體“抬高”。

作為2009年度“溶出度專欄”的結束篇，本文介紹了溶出度實驗注意事項、測定方法的驗證，包括實驗操作環節與測定環節。當然，關于溶出度的研究、應用還將一直持續下去。

實驗操作環節注意事項

（1）有研究表明，明膠交聯對于藥物生物利用度的影響與交聯度呈正相關，溶出介質中加入適量的酶可以有效評價交聯膠囊的溶出度。因此，對于此類產品，應予以相應驗證后在質量標準中明確注明是否需在溶出介質中添加酶以及酶的種類與濃度，并應有體內外相關性研究。

（2）自動取樣裝置由于存在管道吸附和濾膜吸附，故應注意驗證其和手動取樣獲得的數據間有無顯著性差異。

（3）采用轉籃法試驗時，應注意轉籃的潔凈程度，一般在陽光下觀察轉籃的空隙是否有堵塞。如有，可采用超聲或在稀硝酸中煮沸、再在水中煮沸的辦法進行處理。

（4）溶液取出后需進行過濾，過濾的主要目的是為阻斷顆粒繼續溶出和排除其后測定的干擾。濾器一般需用介質預濕潤，過濾時應注意要確保濾膜吸附飽和后再取續濾液，故應驗證達到飽和時的初濾液體積量，一般應不超過5~10ml。濾膜吸附量在2%以內可忽略不計。

曾發現難溶性藥物的小規格制劑，一般均需要較為大量初濾液情況，該因難溶性藥物皆進行了微粉化處理，比表面能增大，而濾膜吸附量為固定值，故需大量初濾液方能至飽和。

此時，建議采用“溶液取出后勿過濾、直接離心取上清液進行測定”的方法進行驗證。對于離心可加速未溶顆粒的進一步溶出，從而人為地增加溶出量的擔心，其實大可不必。因為采用離心，取樣量2ml即可（此類制劑一般均采用HPLC法測定），在取樣位置處存在未溶顆粒和恰好被抽取的概率應該說是幾乎不存在的，所以這點顧慮完全是多余的，擬定采用離心方式的質量標準已有很多。

圖2.  輔料呈一“斜坡形”吸收（下）。

測定方法驗證

溶出度檢測方法除按照既定的方法學認證各項要求進行之外，尚需注意以下事項：

（1）對于某些難溶性藥物，如難以采用溶出介質直接溶解對照品，可先加少量有機溶劑（如甲醇或乙醇）溶解后，再加溶出介質稀釋的辦法。如最終溶液中有機相比例不超過2%，則無論采用何法測定，皆無需驗證，直接使用即可；如超出2%，則應予以相應驗證。

驗證方法：取原料藥粉末，一種方法采用甲醇溶解后用溶出介質稀釋方式；另一種采用置1000ml量瓶中，加900ml溶出介質，置37℃水浴中加熱使溶解后，再加溶出介質稀釋至刻度，搖勻，再稀釋至與前者相同濃度，測定響應值，在98.0%~102.0%間即證明前者所含的有機相對測定無干擾。

（2）線性范圍應考慮到有可能出現的低濃度點情況，如對于溶出曲線或緩/控釋制劑的測定等。并為減小外標一點法的測定誤差，建議將對照品溶液配制為約50%釋放量濃度。

（3）應注意考察活性成分在37℃溶出介質中的穩定性。若不佳，應在質量標準中標注“取出后立即測定”字樣；不建議在溶出介質中加入抗氧劑、穩定劑，以及取出后對溶出液采用繁瑣的穩定措施。

（4）根據實際情況，檢測波長可選取非最大吸收波長甚至末端吸收。

（5）當測定法為紫外法時，由于易受輔料或膠囊殼的影響，建議分別取對照品溶液與供試品溶液進行紫外掃描后根據所得圖譜予以明了，亦可采用高效液相法進行佐證。如干擾存在，可考慮采用雙波長相減法或空白膠囊殼扣除法等方法予以消除，不建議采用紫外導數光譜法；如干擾排除較為困難，建議采用高效液相色譜法測定。

（6）空白膠囊殼干擾在2%以內可忽略不計，若大于2%，則應重新選擇測定法。空白膠囊殼的測定，建議取6粒樣品，徹底清除其中內容物，同法試驗和過濾后，分別量取相同體積混勻測定。測定時以相應溶劑為空白。

（7）不應出現溶出度測定結果均值高于含量測定結果3%以上的情況。如出現，應重新考察溶出度測定方法的適用性。

（8）對于小規格制劑，不建議采用大于1cm的吸收池進行紫外法測定，而建議采用HPLC法（并可酌情加大進樣量以提高測定精密度）。但對于具有較強紫外吸收的活性藥物，為提高工作效率，可考慮采用0.1~1.0cm短吸收池，但必須經過驗證。

（9）紫外測定時典型干擾圖譜

第一種情況，輔料干擾呈“一條平行線”（如圖1），此時可考慮采用兩點法相減。第一點為最大吸收波長、第二點為遠端基線處（如此例中可選擇310nm）。第二種情況，輔料干擾呈“一條斜坡形” （如圖2），此時則應改為HPLC法。

溶出度常見問題問答

謝老師一直在致力于溶出度技術的推廣、交流，除了為本刊主筆“溶出度專欄”外，還于2008年11月開始在某網站開辟“溶出度研究”專版，與網友在線互動，暢談溶出度測定相關問題，令眾多網友受益匪淺，以下是謝老師精選的部分網友在線問答。

Q：試驗時6份樣品需要準備6個過濾裝置嗎？

A：不需要，一個過濾頭，一個針筒，一個取樣針即可。第一份棄去一定體積初濾液使濾膜吸附飽和后，其后樣品則無需再棄去初濾液，取濾液測定皆可。

Q：多條溶出曲線測定的重要性已不言而喻，但是工作量巨大，如何高效便捷地完成測定呢？

A：在測定方法上強烈推薦采用高效液相色譜法。因為溶出曲線上的高低各點響應值差異很大，如采用紫外法，為滿足吸收度值在0.25~0.85間的檢測需要，或采用稀釋法或采用長距離吸收測定池，同時，考慮到輔料/膠囊殼等的干擾，因此不推薦采用紫外法測定。

采用HPLC法，由于線性范圍寬、溶液取出后無需稀釋即可立即進樣；每次可量取1ml，采用液相用濾頭過濾，取濾液測定即可（按照第一個問題的回答，第一份樣品取2ml）；如此，由于取樣體積小、還可省略去測得溶出量的校正計算。同時，為提高測定效率，一者可采用現今越來越普及的超高速液相，幾十秒鐘即可測定一針；或采用增加原有流動相中有機相比例、升高柱溫等措施，使保留時間縮短。

甚至對于一些小規格制劑，由于取樣1ml中所含輔料的可能性極小，可采取勿過濾、直接置于液相小瓶中放置一段時間后，進樣亦可（本人曾多次如此操作，效果良好，但此法不適應于超高速液相）。

Q：請闡述一下漏槽條件對于溶出度試驗的意義。

A：漏漕條件的定義為：溶出介質體積要大于溶解藥物主成分（該量為制劑最大規格量）所需體積的至少3倍量，以保證藥物溶出不受其溶解性的顯著影響。該理念的推出，是美國學者在最初建立溶出度試驗方法時，斟酌確定溶出杯體積時所推出的一個概念，從當時所研究的藥物出發，針對該理念，1000ml的溶出杯可基本滿足大部分藥物。

現今，由于溶出介質體積已固定，通常選用900~1000ml。以此為出發點，如根據某藥物在某溶出介質中的溶解度值來推算采用“何種溶出介質”或“添加多少濃度的表面活性劑”，將完全無視“藥物制劑”的作用，將“藥劑可以改善藥物的水難溶性”這一至關重要的理念完全擯棄了，所以，該理念在現今溶出度試驗應用中已基本無用武之地。

Q：主成分邊溶出邊有一部分（如20%）轉變成另一物質，取出后應如何測定評價呢？

A：遇到此種情況，建議溶液取出后，采取某種處理手段使主成分全部定向轉變后測定該“轉變物”，采用UV法和HPLC法測定均可。

Q：繪制溶出曲線時，最終溶出量一定要達到100%釋放量嗎？

A：不必如此。某種情況下，溶出度釋放會出現飽和，呈現一“平臺期”，只要連續兩點溶出率達90%以上（緩/控釋制劑為85%），且差值在5%以內時，試驗則可結束，沒必要追求至100%溶出量。

Q：配制含有表面活性劑（十二烷基硫酸鈉或吐溫-80）的溶出介質時，為何配置后放置一段時間會析出，導致無法測定？

A：配制含有表面活性劑的溶出介質時，建議將表面活性劑加入水相中，并加入沸石或玻璃珠，置電爐或直火上加熱，并不時采用長玻璃棒攪拌促進其溶解，待液體變得逐漸澄清即將沸騰時，帶上手套迅即移離加熱源，待冷去后使用即可。這樣放置幾天均不會析出。之所以析出，因為采用的是超聲等較弱方式溶解，故不建議如此。

Q：有無方便易行查詢“藥物滲透性”的網站？

A：美國口服藥物傳遞研究公司（Therapeutic Systems Research Laboratories Inc，簡稱TSRL公司）在該公司網站提供了免費查詢系統，網址為：

http://www.tsrlinc.com/services/bcs/index.htm，其中還可查詢該藥物的其他物理化學參數。同時、該網站還有有關BCS分類系統的詳盡闡述，可供參閱。