牛奶中阪崎腸桿菌的檢測方法

引言：
 

  阪崎腸桿菌（又稱阪崎氏腸桿菌）是一種周身無鞭毛，能運動，無芽孢的兼性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌。1980年由黃色陰溝腸桿菌更名為阪崎腸桿菌。阪崎腸桿菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和菌血癥，致死率可達40％～80%，自1961年首次由阪崎腸桿菌引起的新生兒腦膜炎之后，全球范圍陸續出現感染事件，丹麥、希臘、英國、荷蘭、冰島等國均有報道。其嚴重性已引起世界多國相關部門的重視，阪崎腸桿菌已被世界衛生組織和許多國家確定為引起嬰兒死亡的重要條件致病菌。我國也于2005年5月20日通過了《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》行業標準，并于同年10月實施，我國《嬰兒配方食品》和《幼兒配方食品》相關標準規定嬰幼兒配方奶粉、食品中禁止檢出阪崎腸桿菌等致病菌。
 

一、阪崎桿菌的生物學特性
 

1 形態染色
  阪崎腸桿菌屬腸桿菌科腸桿菌屬 , 因此本菌具備腸桿菌基本形態特征 : 革蘭陰性粗短桿菌，有周身菌毛 , 無芽胞, 有動力[1] 。

2 培養特性

  能在普通營養瓊脂、血平板、麥康凱(MAC) 瓊脂、伊紅美蘭 (EMB) 瓊脂、脫氧膽酸瓊脂等多種培養基上生長繁殖。培養最佳溫度 25 ～ 36 ℃ , 在 6～ 45 ℃下都能生長 , 某些菌株可在 47 ℃下生長

[8] 。在胰蛋白胨瓊脂 (TSA) 、腦心浸液瓊脂(BH I) 及血平板上經 25 ～ 36 ℃培養 24 h 后 , 形成 1. 5 ～ 2. 5mm, 黃色菌落。在結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂 (VRBG) 能產生紫紅色菌落[2]。
 

二、阪崎桿菌的傳統檢測方法
 

阪崎腸桿菌檢驗程序見圖 1。 

1 基本步驟如下：

  取檢樣100g（mL）加入已預熱至44℃裝有900mL緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，用手緩緩地搖動至充分溶解，36℃±1℃培養18 h±2h。移取1mL轉種于10mL mLST-Vm肉湯，44℃±0.5 ℃培養24 h±2h。 

  輕輕混勻mLST-Vm 肉湯培養物，各取增菌培養物1環，分別劃線接種于兩個阪崎腸桿菌顯色培養基平板，36℃±1℃培養18 h±2 h。 

  挑取1 個～5 個可疑菌落，劃線接種于TSA平板。25℃±1℃培養48 h±4 h。 自TSA 平板上直接挑取黃色可疑菌落，進行生化鑒定。阪崎腸桿菌的主要生化特征見表 1。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統。 

2 結果與報告 

  綜合菌落形態和生化特征，報告每100g（mL）樣品中檢出或未檢出阪崎腸桿菌。 

3 注意事項

（1）取樣前應對樣品包裝的開啟處和取樣勺進行消毒

（2）檢測樣品不能低于333g
 

三、檢測新技術簡介
 

1 熒光法選擇性培養基法

  該方法也是利用α-葡萄糖苷酶活性的檢測方法[3]。在營養瓊脂基礎上添加4 -甲基-傘形酮-α- D -葡萄糖苷 (α-MUG) 。阪崎腸桿菌在該培養基上形成黃色菌落 , 在紫外光照射下發生熒光。該法靈敏度和特異性都比較好 , 已在多個國家開展使用 , 均取得穩定可靠的結果。

2 對硝基酚光電比色法

  利用阪崎腸桿菌的α-葡萄糖苷酶活性 , 分解對硝基酚-α- D -葡萄糖苷底物 , 釋放黃色的對硝基酚 , 在 405 nm 波長下測定吸光度 , 根據吸光度的大小 , 確定樣品中阪崎腸桿菌是否存在。方法是常規增菌 , 在 VRBG 或 TSA 平板上挑取可疑菌落 , 制備成一定濃度的菌懸液與底物混勻 , 37 ℃ 4 h 后進行比色測定[4]。

3 熒光定量 PCR 方法 　

  熒光定量 PCR 技術的基本原理是在PCR 反應體系中加入熒光基團 , 該基團是一對合適的熒光物質 , 可以構成一個能量供體和能量受體對 , 其中供體的發射光譜和受體的吸收光譜重疊 , 在 PCR 反應基因擴增時 , 激發供體而釋放的熒光能量正好被受體吸收 , 使得供體的熒光強度減弱而受體熒光強度增強 , 利用熒光信號強弱變化積累實時監測整個 PCR 反應過程 , 最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。

  實時熒光定量 PCR 技術已廣泛應用于多種食品微生物污染的檢測。 SEO 等利用阪崎腸桿菌部分大分子合成(MMS) 操縱子基因序列建立了奶粉中阪崎腸桿菌的實時熒光定量 PCR 方法 , 能檢測到 

  0.6-1g 奶粉中的阪崎腸桿菌 , 且比傳統培養法檢測時間從 6 ～ 7 天縮短至 2 天內完成。對 68株阪崎腸桿菌和 55 株非阪崎菌進行檢測 , 未出現假陽性和假陰性 , 具有很好的特異性。
 

結語：
 

  傳統的檢測方法存在操作繁瑣，時間長等缺點,很難滿足現代臨床快速診斷和治療的需求。要了解更準確，快速，簡便，可靠的方法和技術，科學為此已作了大量的研究，試驗方法和識別技術正在不斷發展和完善，并在實踐中不斷取得新的進展。