特殊細胞培養實驗_一、二倍體細胞培養法

細胞

培養液BSS胰蛋白酶消化液

培養瓶

二倍體細胞培養方法與一般培養相同，關鍵在于傳代，其傳代程序為

1.  吸除舊培養液注入另瓶中；

2.  用BSS沖洗1 次；

3.  用0.25%胰蛋白酶消化，加入消化液量以僅覆蓋住細胞層即可；作用1~5 分鐘；

4.  待細胞附著松動、細胞質邊緣卷起和間隔加大，便終止消化；為防止細胞丟失可不必再用BSS沖洗，直接向瓶中加入培養液（新舊培養液按2：1）新舊混合；

5.  輕輕反復吹打制成單個細胞懸液（消化不足或吹打不充分，易形成細胞團，不利于生長，應注意避免）；

6.  按一分為二比例接種培養。

一、要點

1.  采取以下措施可能利于二倍體細胞培養

（1）嚴格控制pH值，最好在5 %CO₂溫箱中培養；

（2）換液時間不要間隔太長，且不要全部更新，盡量保留一部分舊培養液，以棄掉1/2或2/3為妥；

（3）傳代期不能過長，不能讓細胞長得過于密集，一旦細胞接近或剛剛連接成片，即進行傳代；

（4）要選用高質量的培養基和血清，并盡量維持不變，每次傳代都按一分為二的原則（細胞數量、營養液量、培養瓶的空間和面積都不得一樣）進行培養；

（5）傳代后如細胞不用于實驗，立即低溫凍存。

2.  來源于胚胎的二倍體成纖維細胞平均分裂 50 次左右即進入衰退期。

不同種類和來源的二倍體細胞生存期都不一樣，但生存期皆有限。

雖然二倍體細胞具有限的生存期，卻完全能滿足反復使用的要求。

以成纖維細胞為例，即便從初代接種1 個細胞算起，按產生的細胞數=n×2ⁿ（n=接種細胞數）計算，它所提供的細胞也近天文數字。而在實際應用上，初代接種的細胞都幾十萬以上，因此一個二倍體細胞系最終提供的細胞數量近于無限的。

二、討論

如何能保留有大量可利用的二倍體細胞？首先在初代二倍體細胞培養時，要接種多量細胞；生長成功后立即凍存做為種細胞（ Stock）。用于實驗時，解凍1 分Stock，傳1~3 代，按下式處理：

據上，可見二倍體細胞是可長期應用的。